家蚕核型多角体病毒（BmNPV）lef-7基因及鱼传染性胰坏死病病毒（IPNV）VP2基因的分子生物学研究
本论文对家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovims，BmNPV)的某些功能基因进行了更为深入的研究。首先确定了BmNPVlef-7基因精确的翻译和转录起始位点，对gp64基因进行了表达和抗体制备，构建了缺失chiA的BmNPVBactoBac表达系统并对外源基因进行了表达。同时，对传染性胰坏死病病毒(IPNV)的重要功能基因VP2进行了研究。主要结果如下：
1.BmNPVlef-7基因转录和翻译起始位点的鉴定
BmNPVlef-7基因与病毒DNA复制及晚期、极晚期基因的表达有关。序列分析表明，BmNPVlef-7基因编码区的5’端比苜蓿丫蚊夜蛾核型多角体病毒(AutographaCalifornianuclearpolyhedrosisvires，AcNPV>的lef-7基因多出45bp核苷酸序列，然后一直到终止密码子共有42个碱基缺失。在推断的，lef-7基因起始密码子下游46bp处还有一个ATG密码子，并且这两个ATG密码子处于同一个开放阅读框内。为了明确BmNPV，lef-7基因的翻译起始位点是否与AcNPV有所不同，我们对BmNPVlef-7基因的翻译和转录起始位点进行了鉴定。首先克隆了从BmNPV，lef-7基因第二个ATG密码子开始的lef7基因片段，并在大肠杆菌中与GST进行了融合表达，将表达产物纯化后免疫家兔制备了其多克隆抗体。同时构建了缺失其5’端第一个翻译起始密码子ATG开始的¨bp核苷酸序列的BmNPV重组病毒Bmlef7M1一。用制备的抗体LEF-7抗体对BmNPV和Bmlef7M1一感染的家蚕细胞进行Westernblot分析表明二者都能产生一26kDa的特异性条带，与预计的LEF-7大小相符。共聚焦显微分析表明，LEF-7在BmNPV和BmlefTMl一感染的细胞中均位于细胞核内。以上结果表明lef-7基因假定的翻译起始密码子ATG(位于BmNPV基因组97059nt)对于，lef-7基因的表达可能是非必需的。5'-RACE分析表明，BmNPV和Bmlef7M1一感染细胞中lef-7mRNA都是从位于第二个ATG密码子(位于BmNPV基因组97014nt)上游26bp、假定的翻译起始密码子ATG上游20bp处的ATCATTmotif开始转录。
2.BmNPVgp64基因的表达
PCR扩增出1593bp的gp64基因，并分别克隆至原核表达载体pET28a和供体质粒pFastBacHTa中，在大肠杆菌(Eschechiacoli)BL21和杆状病毒BactoBac表达系统中分别进行了表达。gp64基因在大肠杆菌表达量约占细菌总蛋白的10﹪，表达产物主要存在于包涵体中，将表达产物割胶回收后免疫家兔制备了高效价的多克隆抗体。用该抗体去检测昆虫细胞中gp64基因的表达产物野生BmNPV感染的家蚕细胞，均产生与预期大小相符的特异性条带，说明GP64抗体具有较好的特异性，为以后进一步利用pull-down和免疫共沉淀(IP)技术从家蚕培养细胞总蛋白中分离出与BmNPVGP64囊膜糖蛋白相互作用的蛋白提供了重要的研究基础。
3.缺失几丁质酶基因的BmNPV-Bacmid的构建及外源基因的表达
将egfp基因、BmNPVchiA基因上游1550bp及下游1997bp的片段，依次克隆到pSK+载体中，构建缺失chiA基因的转移载体pEGFP△cMA。将转移载体pEGFP△chMDNA和BmNPVBacmidDNA共转染，经过两轮空斑筛选，然后转化大肠杆菌DHl0B菌株，经PCR鉴定得到了egfp基因取代了cMA基因的重组Bacmid，其中chiA基因编码区终止密码子上游497bp的片段被保留。将辅助质粒pMON7124转入含重组Bacmid的DHlOB菌株中，得到了能进行外源基因表达的缺失chM基因的Bact0Bac表达系统DHl0BmBac△cMA。在缺失和未缺失chM基因的BactoBac表达系统中对鱼传染性胰坏死病病毒(IPNV)VP2基因的抗原决定区VP2e分别进行了表达。SDS-PAGE电泳结果显示rBmBac-VP2e和rBmBac△chiA-VP2e感染家蚕细胞后与对照相比均无明显的特异表达条带，但用抗VP2e多克隆抗体及6×His单克隆抗体对表达产物分别进行Western-blot分析表明，在32kDa位置均出现一明显条带，比预期分子量约大了6kDa左右。证明VP2e在重组病毒rBmBac-VP2e和rBmBac△chiA-VP2e感染的细胞中均得到了表达，且表达量无明显的差异。rBmBac-VP2e和rBmBac△ch／A-VP2e感染的蛹血淋巴均能产生一条约32kDa左右的条带，与细胞内表达产物大小一致，且条带没有明显的差异。
4.IPNVVP2抗原决定区(VP2e)研究
已知VP2是病毒衣壳蛋白的主要成分，为糖蛋白，中和抗体产生有关。IPNVAM-98和MABVY-6株系VP2氨基酸序列同源性为88﹪。VP2抗原决定区(VP2e)同源性为84﹪，共32个氨基酸残基有差异，占所有差异残基数的52﹪。克隆了VP2抗原决定区645bp的VP2e片段，并在大肠杆菌中与GST进行了融合表达，表达产物分子量为49kDa，SDS-PAGE检测和薄层扫描表明，融合蛋白表达量约占大肠杆菌细胞总蛋白的25﹪，其中大约90﹪的表达产物以包涵体形式存在。IPNV~P2表达时相分析表明，感染后6h开始检测到IPNVVP2的前体，同时可以检测到少量成熟的VP2，在感染后12-24hVP2前体表达量最高，随着时间的推移直到感染后72h，VP2前体和成熟VP2的水平基本相当。抗IPNVVP2e抗体和抗MABVVP2e抗体检测到的两种病毒感染细胞中的VP2条带基本一致。ELISA分析表明，抗IPNVVP2e抗体对IPNV的特异性比MABV高50﹪左右。兔抗IPNVVP2e抗体能检测到IPNV的最低病毒滴度为9．8×103PFU/ml。检测到的MABV滴度为6.31×105PFU/ml。血清中和实验表明制备的VP2e抗血清能明显中和IPNV病毒的感染，在10-5稀释度，即3.15PFU/ml时可以完全中和IPNV病毒的感染，其中和效应比未免疫的兔血清高了10倍。
5．IPNVVP2e片段在昆虫细胞中的表达及亚细胞定位
将已经克隆的VP2e片段与绿色增强蛋白(EGFP)基因利用BactoBac表达系统在Tn-581.4细胞中分别进行了融合与非融合表达。未融合EGFP的重组病毒感染的细胞中表达产物在32kDa左右，比预计的VP2e分子量(23kDa)再加上6×His大约26kDa稍大，与BmNPVBactoBac系统中表达产物的大小一致。VP2e在Tn细胞中与EGFP融合表达后在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光。SDS-PAGE电泳结果显示，EGFP融合蛋白分子量在52kDa左右，与预期的VP2e分子量(23kDa)和EGFP(29kDa)分子量之和相当。VP2e-EGFP融合表达产物在重组Bacmid感染的Tn-5814细胞中主要分布在细胞质内，与VP2在CHSE-214细胞内的定位结果一致。
家蚕;核型多角体病毒;基因;翻译起点;转录起点;昆虫细胞;基因表达;传染性胰坏死病病毒;抗原决定区;抗体中和
浙江大学
博士后
海洋生物学
杨卫军;张传溪
2006
中文
S476.13
101
2007-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）