獐茅液泡膜Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白基因的克隆及其转基因烟草的耐盐性研究
盐分对植物的伤害主要是Na<'+>引起的，而Na<'+>／H<'+>逆向转运蛋白催化Na<'+>和H<'+>的逆向跨膜运输，是植物抵御盐胁迫的主要方式之一，在植物耐盐性方面起着重要的作用。对于植物Na<'+>／H<'+>逆向转运蛋白基因的克隆、表达及功能的分析将对植物耐盐基因工程产生重要意义。
本研究通过GenBank上登陆的其它植物液泡膜Na<'+>／H<'+>逆向转运蛋白基因的同源序列设计一对简并引物，利用。RT-PCR和RLM-RACE技术获得了獐茅液泡膜Na<'+>／H<'+>逆向转运蛋白基因的cDNA全序列，命名为AlNHXl。AlNHXlcDNA全长2706bp，5′端非编码区387bp，3′端非编码区696bp，含有1个可能的加polyA信号：AATAA，开放阅读框1623个核苷酸，编码一个由540个氨基酸构成的多肽，含有Na<'+>／H<'+>逆向转运蛋白的高度保守序列LFFIYLLPPI，这是Na<'+>／H<'+>逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡嗪嘧的结合位点。该基因氨基酸序列同源性与芦苇(Phragmites australis)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、玉米(Zeamays)、滨藜(Artiplex gmelini)、盐角草(Salicornia europaea)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)的Na<'+>／H<'+>逆向转运蛋白基因分别达到了94％、90％、88％、89％、75％、75％、76％、73％。同时根据RLM-RACE的原理和5′端非编码区序列的分析，推测出目的基因上游的转录起始位点可能为a，为该基因表达调控方面的研究奠定了基础。
根据AlNHX1基因全长序列设计引物扩增其编码区，并将其克隆到pUCl9载体中，经测序确认，保留未发生突变的克隆体，用于构建其植物表达载体pBI121-NHX。冻融法将pBI121-NHX重组质粒导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101中，获得工程菌GV3101-pBI121-NHX。
农杆菌介导法将AlNHX1基因编码区导入烟草(Nictiana tabacum L.cv.89)，获得卡那霉素掘性植株。PCR、RT-PCR及Southern杂交均证明外源AlNHX1基因已整合到烟草基因组中。盐胁迫下转基因烟草的相对电导率显著低于对照，说明转基因烟草的膜结构所受损伤小于对照。转基因烟草具有一定的耐盐性，能在含250 mmol／L NaCl的培养基中正常生长3周，而对照则在100 mmol／LNaCl处理时便不生根。
獐茅;基因克隆;转基因烟草;耐盐性;膜结构;耐盐基因
南京农业大学
硕士
植物营养学
刘兆普;安利佳
2006
中文
S543.5;S572.061
74
2007-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）