利用形态学和RAPD，ISSR分子标记分析68个豇豆品种的亲缘关系
本实验以“成豇7号”豇豆为材料首先研究比较了五种经典的植物DNA提取方法和一种商业试剂盒在豇豆中的提取效果，以期选出一种比较理想的DNA提取方法用于下游分子分析。其次综合运用形态学标记，RAPD和ISSR分子标记来评估68个长豇豆栽培品种的遗传多样性和亲缘关系。主要研究结果如下: (1)在从豇豆幼叶中提取DNA时，两种SDS法所获DNA产量显著性高于三种CTAB法和试剂盒法(Tukey's，P＜0.05)。提取方法对DNA产量有显著影响(F=29.20，df=5，P＜0.01)，对OD260/280比值也有显著影响(F=15.69，df=5，P＜0.01)。在DNA提取时，如果是用于限制性内切酶消化或基于PCR的下游分子操作，RNA酶处理时不是必要的。 (2)当评估完时间和成本、DNA产量、纯度、完整性和功能性之后，由Dellaporta等提出的SDS法被认为是一种理想的从豇豆中提取DNA的方法。该法所获DNA的产量和质量都很高，足以进行上百次的PCR反应，而且能被用于其它DNA分子技术例如限制性消化，Southern杂交和克隆。另外，它还有一个额外的优点就是不需要任何苯酚或氯仿提取。 (3)本实验用Premix Taq对长豇豆品种进行RAPD和ISSR分析，并对DNA模板浓度和引物浓度进行了优化。根据琼脂糖凝胶电泳图结果，筛选出的最佳的反应体系为每25μl反应体系中含DNA模板40ng，引物0.8μmol/L，Premix Taq12.5μl，ddH2O补足25μl。 (4)用梯度PCR仪在44℃到55℃之间筛选每条ISSR引物的退火温度。根据琼脂糖凝胶电泳图选出最佳的退火温度。本实验所用ISSR引物的GC含量在44％到55％之间，有的在较低的退火温度下扩增较好，有的则在较高退火温度下表现好，呈现不规则性，并且与GC含量没有明确的关系。所以，要想得到每一条引物的最佳退火温度，需要进行实验，而不能仅靠理论计算或对理论计算的结果进行某种校正。 (5)从22条RAPD引物中筛选出9条对68个长豇豆品种进行扩增，共得到56条带，平均每条引物6.22条。其中21条具有多态性，占比37.50％。从18条ISSR引物中筛选出14条，总共扩增出116条带，平均每条引物8.28条。其中38条具有多态性，占比32.76％。 (6)基于标准两样本t检验，在平均PIC值、标记指数(MI)、解析能力(RP)之间并没有显著的差异，表明在检测多样性和个体鉴定方面，RAPD和ISSR同样有效。证明了RAPD和ISSR技术是对长豇豆种植资源进行分子鉴定和遗传关系分析的有力工具。但是，ISSR标记由于其更好的稳定性，更高的条带亮度和更多的每条引物获得的多态性带，因此比RAPD标记略有优势。 (7)通过Mantel检验，发现RAPD和ISSR有较高的一致性(r＞0.67)，而分子标记和形态标记之间有较低的一致性(r＜0.2366)。其中，有三种形态性状，包括荚色、荚宽和荚重，与所有的分子标记数据都有显著的相关性。 (8)通过对68个长豇豆栽培品种的形态学性状的统计分析，发现供试品种形态性状表现出显著的差异。而根据RAPD和ISSR标记所计算出的材料间的Nei's遗传距离分别介于0.00-0.18和0.00-0.14，表明遗传基础相对狭窄。因此将分子标记和形态学标记结合起来分析对综合理解材料之间所存在的遗传变异模式是有必要的。 (9)本研究发现，中国长豇豆栽培品种之间的遗传多样性极低。在亚洲发现了很多不同的长豇豆地方品种，与栽培品种相比，这些地方品种一般都具有更广的遗传基础。因此，从地方品种资源或普通豇豆中引入外源基因到栽培品种中，可以增加种质资源的多样性，可用于培育长豇豆优良品种。
长豇豆;DNA提取;遗传多样性;分子标记
四川农业大学
硕士
蔬菜学
李焕秀
2014
中文
S643.4
72
2015-05-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）