田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶Prx1和Prx的鉴定及功能分析
最近几年，田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)已成为一个新型的人类病原体，也是世界上的许多地区人类巴贝斯虫病的主要病原体。虫体内的过氧化物氧化还原酶（Peroxiredoxins，Prxs）是细胞中一类表达丰富的蛋白质。Prxs蛋白家族和其它抗氧化蛋白酶，如SOD，Gpx，Trx及TrxR一样在保护虫体内的生物大分子免受不利因素的影响方面发挥着重要作用。Prxs还原过氧化氢主要依赖其高度保守的具有氧化还原活性的Cys。Prxs蛋白被划分为Prx1，Prx5，Prx6，TPX，PrxQ和AhpE六个亚科，本实验中研究的是其中的Prx1和PrxQ。虽然这种寄生虫的Prxs基因组已被测序和注释，但其生物性特性尚不清楚。 本实验通过分子生物学技术获得了Prx1和PrxQ全长序列基因，其中Prx1全基因序列长度为594bp，具有一个编码194个氨基酸的开放阅读框（ORF），该蛋白无信号肽，利用软件推测Prx1的蛋白大小约为23kDa。PrxQ全基因序列长度为537bp，具有一个编码194个氨基酸的ORF，其ORF中有一个信号肽序列，利用软件推测PrxQ的蛋白大小约为21kDa。我们也成功构建了以pET-30a为载体的重组质粒，并转化至BL21感受态细胞中的原核表达系统。通过对诱导条件的摸索，确定在1mM IPTG诱导，200rpm，37℃摇床振荡培养12h时能获得大量的重组蛋白，并通过Prx1和PrxQ上清进一步纯化获得了纯度较高的重组蛋白，符合进一步实验的要求。 Prx1和PrxQ重组蛋白活性分析表明证明Prx1和PrxQ蛋白都有活性，但Prx1蛋白活性更高。在构建重组质粒时我们发现，PrxQ的序列中有一段信号肽，可能这决定了Prx1和PrxQ在细胞中的分布位置不同，从而使两种蛋白发挥不同的功能。关于田鼠巴贝斯虫各种Prxs的具体作用，需要后续实验的进一步研究。另外，通过Western blot鉴定和间接免疫荧光实验（IFAT）分析证明已经成功制备了Prx1和PrxQ多抗血清，同时Western blot鉴定证明虫体Prx1和PrxQ天然蛋白在虫体中以单体的形式发挥抗氧化作用，且虫体在红细胞中分裂高峰时Prx1和PrxQ大量表达。IFAT证明Prx1和PrxQ天然蛋白大量存在与细胞浆中。本文以B.microti Prxs为重点，解析其生物学特征及功能，展望了B.microti Prxs的研究和应用前景，以期为研究B.microti的致病机理及研发原虫病疫苗提供参考，并为更深入的研究提供依据。
巴贝斯虫病原体;过氧化物氧化还原酶;原核表达;生物学特征
山东农业大学
硕士
兽医
王振勇
2016
中文
S852.7
60
2016-09-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）