一株α-环糊精葡萄糖基转移酶产生菌的选育、鉴定、产酶条件优化和酶学性质的研究
环糊精(cyclodextrin，缩写CD)是由α-1,4-糖苷键相连而成的，环状的，无还原端的麦芽低聚糖。环糊精通常由6、7或8个葡萄糖残基组成，分别被称为α-、β-、或γ-环糊精。除了这三种常用的环糊精外，还有δ-、ε-、ζ-和η-环糊精（分别由9~12个葡萄糖单元组成）。环糊精具有能够将多种化学物质全部或部分封装入空腔内的能力，从而改变了这些化合物的物理和化学性质。这一特性使环糊精在医药、食品、化工、化妆品、工业和农业以及分析化学等方面得到广泛的应用。目前环糊精的制备主要是采用酶法合成的，化学合成法并不常用，而酶法制备会产生多种环糊精的混合物，不利于单一环糊精的分离纯化，这极大限制了环糊精的应用。因此，寻求一种能够催化生成特定环糊精的CGTase的生产菌，成为降低环糊精分离纯化成本所关注的焦点。本实验通过菌株的筛选和选育得到一株产α-CGTase的诱变菌株Y112；以单因素法结合响应面优化了该菌株的发酵培养基成分和发酵条件；同时对α-CGTase进行纯化，并研究其酶学性质，结果分述如下： 菌株的分离筛选及鉴定：用活性平板法进行菌种筛选，对其中透明圈与菌株直径之比较高者进行摇瓶复筛测酶活，其中以代号112菌株活力最高。采用亚硝基胍和利福平复合诱变的方法对菌株112进行诱变，选取致死率95％的剂量，再经过初筛复筛得到遗传稳定的诱变株 Y112，其产酶能力较出发菌株提高了37%。通过形态学、生理生化指标以及16S rDNA的序列对比进行产酶菌鉴定，初步鉴定为芽孢杆菌。 菌株产酶条件优化：通过单因素筛选对菌株产酶的培养基成分(碳源、氮源、金属离子、磷酸盐、盐度、pH)和培养条件（装液量、接种量、温度、摇床转速、培养时间）进行优化。根据单因素试验，挑选出对菌株产酶影响较大的八个因素，先用Plackett-Burman试验筛选出3个主要影响因素(蛋白胨、酵母浸粉、温度)，然后采用中心组合法对这三个主要因素进行优化。最终根据单因素和响应面法得出菌株Y112的最佳培养基成分为：玉米淀粉7.5g/L，蛋白胨17.8 g/L，酵母浸粉9.1g/L，Mn2+0.6 mmol/L，NaCl50 g/L，Na2CO315 g/L(pH9.6)。最佳产酶的培养条件为：250 mL三角瓶装液25mL，接种量为4%，27℃、230 r/min发酵培养50 h。菌株产酶条件经过优化后，酶活提高为原来的2.8倍。 酶的纯化：发酵制备的α-CGTase粗酶液，经过三步纯化获得电泳纯酶样品：首先筛选出最佳的乙醇分级沉淀条件；然后选取对α-CGTase酶稳定性无影响的缓冲体系，将乙醇分级沉淀后的样品进行Superdex200分子筛层析和DEAE-Sepharose离子交换层析纯化，最终酶的纯度提高了12.4倍，酶活回收率为57.5%。最终纯化的样品在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上显示为一条带，以标准蛋白分子量的对数(logMr)与迁移率(Rf)作图，得到回归方程，然后带入目的蛋白迁移率求得测定其分子量为90 kDa。 酶学性质：菌株Y112所产α-CGTase的最适pH为8.5，最适反应温度为55℃；在pH7.0-9.0和45℃以下稳定；Ag2+会使酶完全失活，Ba2+、Li+、Cu2+、Hg2+、Al3+、吐温20、CTAB、DMSO对酶活影响不大，Mn2+、Mg2+对酶活性有一定的促进作用；而Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、EDTA、SDS在一定程度对酶活有抑制作用；根据Hanes-Woolf作图法，以[S]/v对[S]作图，根据回归方程可以求得该酶以可溶性淀粉为底物的米氏常数Km为5.5 g/L，Vmax=0.25μmol/L/min。
环糊精葡萄糖基转移酶;菌株筛选;发酵优化;产酶条件;酶学性质
上海海洋大学
硕士
食品科学与工程
孙谧
2015
中文
TQ920.6
62
2016-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）