小细胞肺癌细胞系H446肿瘤干细胞能量代谢的初步研究
目的: 1.阐明小细胞肺癌干细胞的能量代谢状态。 2.揭示小细胞肺癌干细胞的主要产能途径。 3.探讨干预主要产能途径对小细胞肺癌干细胞干性的影响。 方法: 1.课题组前期工作证明在小细胞肺癌细胞系H446中，uPAR+细胞群富集了干细胞样细胞。因此，本实验通过流式细胞术从H446中分选出uPAR+细胞作为肿瘤干细胞，uPAR-细胞作为非干癌细胞。 2.比较uPAR+细胞与uPAR-细胞的能量代谢状态： (1)利用 CellTiter-Glo?发光法细胞活力检测试剂盒，检测 uPAR+细胞与uPAR-细胞的ATP含量； (2)检测反映uPAR+细胞与uPAR-细胞氧化磷酸化水平的相关指标：a.利用海马生物能量测定仪 XF24，检测细胞的氧消耗率和线粒体储备能力；b.采用活性氧检测试剂盒，检测细胞的活性氧水平；c.利用透射电镜技术，观察细胞的线粒体结构。 (3)检测反映uPAR+细胞与uPAR-细胞糖酵解水平的相关指标：a.利用海马生物能量测定仪XF24，检测细胞的细胞外酸化率和糖酵解的储备能力；b.利用荧光标记的2-脱氧葡萄糖类似物2-NBDG，检测细胞的葡萄糖摄取能力；c.采用乳酸测定试剂盒，检测细胞的乳酸生成率。 3.比较uPAR+细胞与uPAR-细胞的主要产能途径： (1)单独给予糖酵解抑制剂2-DG后，比较 uPAR+细胞与 uPAR-细胞的ATP含量变化。 (2)单独给予氧化磷酸化抑制剂寡霉素后，比较 uPAR+细胞与 uPAR-细胞的ATP含量变化。 (3)联合应用寡霉素和2-DG后，比较uPAR+细胞与uPAR-细胞的ATP含量变化。 4.探究寡霉素对uPAR+细胞增殖及自我更新能力的影响： (1)通过MTT实验,比较寡霉素处理前后uPAR+细胞增殖能力的变化。 (2)通过肿瘤球形成实验，比较寡霉素处理前后uPAR+细胞体外成球能力的变化。 (3)通过裸鼠移植瘤实验，比较寡霉素处理前后uPAR+细胞体内致瘤能力的影响。 结果: 1.小细胞肺癌干细胞与非干癌细胞能量代谢状态的比较 (1) uPAR+细胞的ATP含量显著低于uPAR-细胞(P<0.05)。 (2) uPAR+细胞的基础氧消耗率和线粒体储备能力均低于uPAR-细胞(P<0.05)；进一步检测两群细胞的活性氧水平，结果显示uPAR+细胞的活性氧水平低于uPAR-细胞；但透射电镜的结果表明 uPAR+细胞的线粒体结构与uPAR-细胞没有明显差异。 (3) uPAR+细胞的细胞外酸化率和糖酵解储备能力均低于uPAR-细胞(P<0.05)；葡萄糖摄取率检测结果显示uPAR+细胞的葡萄糖摄取能力低于uPAR-细胞(P<0.05)；而且 uPAR+细胞的乳酸生成率也显著低于uPAR-细胞(P<0.05)。 2.小细胞肺癌干细胞与非干癌细胞主要产能途径的比较 (1)单独应用寡霉素后，uPAR+细胞ATP下降幅度大于uPAR-细胞(P<0.05)。 (2)单独应用2-DG后，uPAR-细胞ATP下降幅度较大(P<0.05)。 (3)联合应用2-DG和寡霉素后，uPAR+细胞的ATP含量高于uPAR-细胞(P<0.05)；在缺氧环境下，联合抑制后的uPAR+细胞 ATP水平较常氧环境更高(P<0.05)，uPAR-细胞则无明显变化(P>0.05)。 3.抑制主要产能途径对小细胞肺癌干细胞增殖和自我更新能力的影响 (1) MTT实验结果显示：2-DG能抑制 uPAR-细胞的增殖却不能抑制 uPAR+细胞的增殖，而寡霉素能够同时抑制 uPAR-细胞与 uPAR+细胞的增殖(P<0.05)； (2)肿瘤球形成实验结果显示：氧化磷酸化的抑制剂寡霉素可显著影响uPAR+细胞的成球率和成球体积(P<0.05)，而2-DG对其几乎没有影响； (3)动物移植瘤实验结果显示：寡霉素处理的uPAR+细胞致瘤率、致瘤体积和瘤体重量均低于未处理组(P<0.05)。 结论 1.小细胞肺癌干细胞与非干癌细胞能量代谢状态不同，是一群代谢休眠的细胞。 2.小细胞肺癌干细胞与非干癌细胞的产能途径不同，其主要依赖氧化磷酸化产能。而且，在缺氧条件下还可以通过线粒体底物水平磷酸化产生部分能量。 3.抑制氧化磷酸化可以降低小细胞肺癌干细胞的干性。 综上所述，小细胞肺癌干细胞是一群能量代谢状态相对不活跃的细胞，氧化磷酸化是其主要产能途径，临床上针对糖酵解的治疗策略只能杀伤非干癌细胞而对肿瘤干细胞无效。在缺氧条件下，小细胞肺癌干细胞可以通过线粒体底物水平磷酸化产生部分能量；同时，抑制氧化磷酸化可降低小细胞肺癌干细胞的干性。因此，该研究将对研发靶向癌干细胞代谢的相关治疗有重要价值。
小细胞肺癌;肿瘤干细胞;能量代谢;氧化磷酸化
天津医科大学
硕士
基础医学
仇晓菲
2015
中文
R734.2
63
2016-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）