TGF-β1促进肺鳞癌及肺肉瘤样癌EMT、VM形成的研究
近几年我国吸烟人数不断增加，人们生存的环境也不断恶化，肺癌的发病率也随之上升，在全国恶性肿瘤的总发病率已占据了首要位置，成为对人健康和生命产生威胁最大的恶性肿瘤之一。在近几年肺癌的发病年龄也逐渐年轻化，在男性肺癌发病率和死亡率均占第一位，女性发病率、死亡率仅次于乳腺癌居第二位，威胁人类的健康显而易见。 目的: 研究肺肉瘤样癌（pulmonary sarcomatoid carcinoma，PSC）和肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma，LSCS）中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、EMT相关蛋白的表达情况，分析其相关性。并探讨肺肉瘤样癌中TGF-β1与血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）的关系及对临床生存、预后的影响。通过体外TGF-β1诱导肺鳞癌细胞发生EMT表型转变及细胞运动能力的影响，并阐述EMT提高肺鳞癌细胞的侵袭迁移能力、VM形成的相关机制。 方法 1)分析天津医科大学肿瘤医院1995年1月至2010年12月在手术前没有接受放化疗治疗的肺肉瘤样癌患者41例、肺鳞癌患者79例的临床资料，总结其随访结果。分别对肺肉瘤样癌和肺鳞癌进行TGF-β1和EMT相关指标E-cadherin、Vimentin、Twist1进行免疫组化染色，分析两组中TGF-β1与EMT相关蛋白的关系。并对人肺肉瘤样癌病例组织切片41例进行CD31和PAS双重染色，分析在肺肉瘤样癌中TGF-β1与VM之间的预后关系。最后对VE-cadherin、MMP-2蛋白进行免疫组织化学染色，分析肺肉瘤样癌中VM形成的相关机制。 2)通过培养SK-MES-1肺鳞癌细胞株，并利用TGF-β1对肺鳞癌细胞进行诱导。观察是否发生EMT，同时促进了VM的形成。利用细胞功能学的一些方法，观察经过诱导后的肺鳞癌细胞的侵袭能力变化、迁移速度改变，还有三维管道形成能力。 3）应用Western Blot、RT-PCR、免疫荧光染色实验从蛋白和mRNA水平检测E-cadherin、Vimentin表达情况，从机制上探究肺鳞癌细胞经诱导后发生EMT，从而促进VM的形成。 4） Western Blot检测VE-cadherin作为血管生成拟态形成的关键，在TGF-β1诱导前后的表达差异。 5）利用明胶酶谱来检测TGF-β1诱导后肺鳞癌细胞的基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9活性的影响。 结果 1）肺肉瘤样癌、肺鳞癌EMT相关蛋白、TGF-β1的表达 通过对41例肺肉瘤样癌、79例肺鳞癌的EMT相关蛋白免疫组化染色，发现与肺鳞癌相比，肺肉瘤样癌的E-cadherin表达下降，Vimentin表达明显增强，两组间比较差别具有统计学意义。随后通过TGF-β1、Twist1的免疫组化染色，发现在肺肉瘤样癌和肺鳞癌两组中，TGF-β1与Twist1的差别具有统计学意义。 2） TGF-β1蛋白与血管生成拟态的形成有关 41例肺肉瘤样癌病例中TGF-β1的阳性表达率为43.9％（18/41）。VM阳性组TGF-β1的阳性表达率为80%（8/10）；VM阴性组TGF-β1的阳性表达率为32.3%（10/31）。TGF-β1在VM阳性组和VM阴性组的阳性表达率的差别具有统计学意义。生存分析表明，TGF-β1阳性组较阴性组的总体生存时间短。 3） TGF-β1对肺鳞癌细胞的诱导通过体外三维培养证实其促进了肺鳞癌细胞血管生成拟态的形成，增强了肺鳞癌细胞的侵袭和迁移能力 经过TGF-β1诱导后的肺鳞癌细胞在Matrigel三维培养模型上能够形成VM，且管道化结构较复杂。Transwell小室体外侵袭实验发现不同浓度TGF-β1诱导不同时间的肺鳞癌细胞，与未处理组相比，浓度高且诱导时间长的实验组穿过Matrigel胶形成的基底膜的细胞数越多，实验结果显示，组间差别具有统计学意义。划痕实验也发现，TGF-β1诱导10d、15d组的肺鳞癌细胞在48h伤口完全愈合，其速度均高于未处理组，差别具有统计学意义。进一步证明诱导后的肺鳞癌细胞，其侵袭性和移动能力较未处理组明显增强。 4）体外实验TGF-β1诱导肺鳞癌细胞发生EMT，促进了VM的形成 细胞免疫荧光实验证实SK-MES-1细胞在TGF-β1诱导后不仅在形态上发生了变化，同时也发生了EMT，出现了抗原表型的转变，由上皮的表型转变成间充质表型。Western Blot及 RT-PCR检测经诱导后的细胞蛋白和mRNA表达，证实了诱导后的肺鳞癌细胞Vimentin蛋白及mRNA水平均显著上调表达，E-cadherin表达下调。以上结果进一步证实肺鳞癌细胞发生EMT样可塑性转变，从而促进了血管生成拟态的形成。 5） VM形成的关键蛋白VE-cadherin和基质金属蛋白酶MMP-2在TGF-β1诱导后表达显著升高 在人肺肉瘤样癌的石蜡切片上已经初步证实具有 VM的肺肉瘤样癌病例中VE-cadherin、MMP-2蛋白高表达，其中MMP-2的高表达说明了肺肉瘤样癌侵袭性强、预后差、5年生存率低的特点。且体外Western Blot检测出肺鳞癌细胞在TGF-β1诱导后，血管生成拟态关键蛋白VE-cadherin呈现高表达；明胶酶谱实验证实诱导15d后的SK-MES-1细胞较未处理组的MMP-2的活性增高。 结论 1）肺肉瘤样癌中发生了EMT，其EMT表型的机制可能与TGF-β激活转录因子Twist1促进EMT发生有关。 2）转化生长因子TGF-β1与转化生长因子-β1血管生成拟态有关，促进了肺肉瘤样癌中VM的形成。 3）经过TGF-β1诱导的肺鳞癌细胞，其侵袭性和运动能力得到增强，管道形成能力增强。 4） TGF-β1促进了VM形成的关键蛋白VE-cadherin表达上调。 5） TGF-β1诱导肺鳞癌细胞可发生EMT，进而促进了VM的形成。
肺肉瘤样癌;肺鳞癌;上皮间充质转化;血管生成拟态 T;转化生长因子-β1
天津医科大学
硕士
基础医学
孙保存
2015
中文
R734.2
69
2016-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）