NECA诱导抗心肌/缺血再灌注损伤保护作用的线粒体机制研究
目的: 探讨非选择性腺苷受体激动剂5’-N-乙基酰胺基腺苷(5，-(N-ethylcarboxamid-o) adenosine，NECA)对缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）损伤心肌细胞的保护作用及其相关线粒体机制研究。 方法: 利用H9c2心肌细胞系建立模拟I/R损伤模型，采用CCK-8细胞活性测定试剂盒检测细胞活性；通过线粒体膜电位检测试剂盒（Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1）检测细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，△Ψm)；使用Amplex red过氧化氢/过氧化物酶试剂盒（Amplex red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit）测定细胞内H2O2水平，活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit with DCFH-DA）检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平，Mitosox red线粒体超氧化物指示剂（Mitosox red mitochondrial superoxide indicator）检测线粒体内ROS水平；利用复合体I酶活性检测试剂盒（Complex I enzyme activity assay kit）检测线粒体呼吸链复合体 I的活性。 结果: 1.不同浓度NECA（0.1、1、10μmol/L）对I/R后心肌细胞活性具有不同程度的保护作用(均P<0.05)，其中以1μmol/L时保护作用最为明显，因此我们使用该浓度进行后续实验； 2. I/R后细胞活性明显降低，NECA可抑制I/R后细胞活性的下降，而腺苷A2A受体拮抗剂SCH58261、腺苷A2B受体拮抗剂MRS1706单独或联合使用均可阻断NECA对细胞的保护作用(均P<0.05)，提示NECA通过激活腺苷A2A和A2B受体发挥其抗I/R损伤心肌保护作用； 3. I/R后细胞JC-1红绿荧光强度比值明显降低，说明I/R导致△Ψm的显著降低，提示I/R导致线粒体通透性转换孔(Mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)的开放。NECA可抑制I/R后细胞△Ψm的改变，而腺苷A2A和A2B受体拮抗剂单独或联合使用均可抑制NECA对△Ψm的保护作用(均P<0.05)，提示NECA通过激活腺苷A2A和A2B受体而发挥其抗I/R损伤心肌保护作用，其机制可能与抑制I/R损伤引起的mPTP的开放有关； 4. I/R损伤后细胞Amplex red、DCF、Mitosox red荧光强度均显著增强，说明I/R使细胞以及线粒体ROS的含量增加。NECA可抑制I/R后细胞内上述各荧光强度的增高，而腺苷A2A或A2B受体拮抗剂均可阻断NECA的作用(均P<0.05)，提示NECA通过激活腺苷A2A和A2B受体来减少细胞及线粒体ROS的产生，进而发挥其心肌保护作用； 5. NECA可降低I/R后线粒体复合体I的活性，而腺苷A2A或A2B受体拮抗剂均可逆转NECA对I/R损伤后细胞内线粒体复合体I活性的影响(均P<0.05)，提示NECA激活腺苷A2A和A2B受体后产生的心肌保护作用可能与抑制线粒体复合体I的活性有关； 6. Src酪氨酸激酶的选择性抑制剂PP2可抑制NECA对I/R损伤后细胞活性的保护作用(P<0.05)，提示Src酪氨酸激酶可能介导NECA的心肌细胞保护； 7. Src酪氨酸激酶的选择性抑制剂PP2可抑制NECA对I/R后细胞△Ψm的作用(P<0.05)，提示NECA抑制mPTP开放的作用可能与Src酪氨酸激酶的激活有关； 8.与NECA组相比，PP2+NECA组细胞Amplex red、DCF、Mitosox red荧光强度均显著增强(均P<0.05)，提示NECA对I/R后细胞内以及线粒体ROS增高的抑制作用可能与Src酪氨酸激酶的激活有关。 结论 1. NECA通过激活腺苷A2A和A2B受体从而发挥抗I/R心肌保护作用； 2. NECA可能通过抑制线粒体ROS的产生而抑制mPTP的开放并减轻I/R损伤； 3. NECA可能通过降低再灌注期线粒体复合体I活性而抑制ROS的产生； 4. Src酪氨酸激酶可能介导NECA的保护作用。
心肌细胞;缺血/再灌注损伤;5’-N-乙基酰胺基腺苷;保护作用;线粒体机制
天津医科大学
硕士
基础医学
徐哲龙
2015
中文
R329.2;R542.2
72
2016-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）