吖啶橙荧光染色法检测肾癌循环肿瘤细胞及其临床意义
目的： 应用吖啶橙荧光染色法（acridine orange fluorescent，AO-F）搭建循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）筛选平台，并将其应用于肾癌患者外周血CTCs筛查，评估其在肾癌患者中的临床价值。 方法： 1、培养肾癌组织原代细胞和肿瘤细胞株769-P，AO-F法染色后加盖片于荧光显微镜下观察细胞形态及着色情况。分别制备死亡肿瘤细胞（75℃水浴30min）和活肿瘤细胞（加新鲜PBS放置30min）。AO-F染色后分别计数5个随机视野下两组细胞中AO-F+细胞所占的比例，评估AO-F染料对肿瘤细胞的敏感性。 2、抽取健康体检者肘正中静脉血5 ml，红细胞裂解液法富集单个核细胞，PBS逐级稀释，配制为含106个单个核细胞的细胞悬液于玻璃管中，共20管。将不同数量的769-P细胞（500、200、100、50、10个/管）与106个单个核细胞混合以模拟肾癌患者外周血CTCs模型，AO-F染色后计算各组肿瘤细胞回收率，验证该方法敏感性和可重复性。 3、使用上述方法检测139例肾癌患者（112例早期患者和27例转移患者）、10例良性肾病患者外周血中CTCs的表达水平。并分析10例健康志愿者的外周血样，评估此方法的特异性。 4、分析CTCs表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、T分类、furhman分级、是否转移等临床病理参数之间的关系。 结果： 1、肾癌组织原代细胞和肿瘤细胞株的形态和着色情况无明显差异。活肿瘤细胞组呈现典型的AO-F+细胞特性，而死亡肿瘤细胞组却未能呈现出相应特征。平均每个视野下 AO-F+细胞占肿瘤细胞的比例为93％±3%，吖啶橙染料与肿瘤细胞具有较高敏感性。 2、含500、200、100、50个肿瘤细胞的悬液组肿瘤细胞回收率（%）分别为：10.2±3.8、9.2±2.3、10.8±2.6、10.5±1.9，组间差异无统计学意义（F=1.001，P＞0.05）。4组敏感性实验肿瘤细胞平均回收率为10.16±2.73%。含10个细胞的悬液组偶然可测到AO-F+细胞。加入的肿瘤细胞越多，检出的AO-F+细胞数越多，两者间存在Pearson正相关（Pearson=0.959，P=0.00）。 3、139例肾癌患者中19例（19/139,13.67%）可检测到CTCs，早期和转移患者分别为10例（10/112，8.93%）和9例（9/27，33.33%）。10例健康志愿者、10例良性肾病患者均未检测到CTCs。 4、总体检出水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、T分类、Furhman分级均未见相关性（P>0.05），但与患者是否转移有明显相关（P＜0.05）。早期患者和转移患者的检出情况与临床病理参数之间均未发现统计学差异（P>0.05）。 5、在早期患者和转移患者之间，阳性检出率在患者年龄、性别、肿瘤大小、T分类（T2/3)、Furhman分级之间均未发现统计学差异(P＞0.05)。但在T1有统计学差异（P＜0.05）。 结论： 证实了吖啶橙染料对肿瘤细胞具有较高敏感性，AO-F染色法筛查外周血CTCs切实可行，并具有较高的可重复性和特异性。CTCs可作为预测肾癌患者是否发生转移的一个重要指标，对早期预测肾癌复发转移有一定参考价值，值得进一步探索。
循环肿瘤细胞;吖啶橙荧光染色法;肾癌;阳性率;临床价值;外周血筛查
天津医科大学
硕士
基础医学
马富玲
2015
中文
R737.11;R730.43
67
2016-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）