胃癌中miR-124表达的意义及作用机制研究
第一部分 miR-124在胃癌中表达降低 胃癌在全世界属常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率及死亡率均居恶性肿瘤的前列。但胃癌发病的分子机制至今尚未完全明了，新近大量肿瘤表观遗传学研究资料表明，在人类多种肿瘤的发生发展过程中存在表观遗传学的改变。表观遗传调控机制包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构及非编码RNA等。非编码RNA是近年来的肿瘤研究新热点之一，miRNA参与了胃癌的发生发展及转移等过程。研究表明miR-124在人类多种肿瘤中发挥着抑瘤基因的作用，其在胃癌中的表达及意义尚不清楚。 目的：检测分析miR-124在胃癌细胞及组织中的表达。 方法：本研究采用qRT-PCR，检测了miR-124在永生化胃粘膜上皮细胞GES1及胃癌细胞系MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901及AGS中的表达；采用原位杂交，检测了miR-124在胃癌及癌旁正常组织中的表达，分析miR-124表达与胃癌患者临床病理意义及预后的关系。 结果：miR-124在MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901及AGS细胞中的表达，均低于GES-1细胞；miR-124在胃癌组织表达降低或缺失，而在癌旁胃粘膜中的表达呈强阳性，miR-124表达与胃癌病理组织学分级、TNM分期及淋巴结转移密切相关，而与患者的年龄、性别及肿瘤大小无关，miR-124低表达与患者预后及生存时间有关。 结论：miR-124在胃癌组织及细胞系中均存在miR-124的表达下降，其表达与胃癌分级、分期及淋巴结转移及患者预后相关。 第二部分 miR-124调控EZH2表达对胃癌细胞系增殖及药物增敏性 miRNA在肿瘤细胞的生长增殖、周期调控、凋亡、侵袭转移、血管形成、上皮间质样变及干细胞特性维持等过程发挥重要作用；miR-124具有抑制肿瘤生长、增殖及化疗药物增敏作用。 目的：探讨初步miR-124在胃癌中的作用及分子机制。 方法：本研究采用MTT法，检测miR-124的转入，对胃癌细胞系生长增殖及5-Fu药物增敏作用的影响；采用软琼脂克隆形成实验，检测 miR-124转入MKN-45、AGS细胞系，对MKN-45、AGS细胞克隆形成能力的影响；施用裸鼠成瘤实验，探讨miR-124对裸鼠荷瘤生长增殖的影响，体内实验验证miR-124在胃癌细胞的作用。通过在线软件预测分析miR-124的靶基因，EZH2基因可能是miR-124所调控的靶基因，运用荧光素酶报告分析、qRT-PCR及Western blot等方法，实验证实EZH2基因是miR-124所调控的靶基因；采用免疫组织化学及原位杂交方法，分析 miR-124与 EZH2在胃癌组织中表达、相关性及临床病理意义；MTT法，检测EZH2对AGS细胞系增殖影响，分析miR-124增强AGS细胞对5-Fu的敏感性。 结果：转染miR-124 mimics后，GES-1、MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901及AGS细胞的存活率分别为：91.6±9.3％、68.4±5.7%、54.7±3.5%、64.2±6.1%、38.9±3.7%、43.6±5.2%及63.1±4.8%；与 GES-1比，MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901及 AGS细胞的存活率均显著降低。转染miR-124 mimics后，MKN-45细胞克隆形成率（22.3±2.1%）与AGS细胞克隆形成率（59.1±4.7%）均较对照组降低。裸鼠成瘤实验表明，miR-124 mimics治疗组移植瘤大小及重量明显小于对照组。miR-124可增加5-Fu对AGS细胞的抑制作用。miR-124可以与EZH23’UTR结合，并在胃癌细胞中抑制其表达，并且EZH2在胃癌组织中的表达与miR-124呈负相关。EZH2的表达与胃癌患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移无关，但是与肿瘤分化程度密切相关。EZH2 siRNA转染AGS细胞后24 h的增殖率与对照组无显著差异，而48 h及72 h的细胞增殖率明显低于对照组。miR-124 inhibitor与si-control组的细胞增殖率大于inhibitor control与si-control组，EZH2 siRNA与inhibitor control组细胞增殖率低于inhibitor control与si-control组，而miR-124 inhibitor与EZH2 siRNA组的细胞增殖率较对照组无明显变化。 结论：miR-124可体外抑制胃癌细胞增殖，体内抑制成瘤，并增加胃癌细胞对5-Fu的药物敏感性，miR-124的直接靶基因EZH2在胃癌组织中表达与肿瘤分化程度相关，参与了miR-124对胃癌细胞5-Fu敏感性的调控。
胃癌;miR-124;药物敏感性;5-氟尿嘧啶
南华大学
博士
基础医学
贺修胜
2015
中文
R735.2
117
2016-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）