miR-590靶向抑制巨噬细胞LPL对apoE基因敲除鼠动脉粥样硬化的影响
动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）是As性心脑血管疾病的共同病理改变，其中巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应在 As发生发展中起着重要作用。减轻巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应的调控措施对防治 As性心脑血管疾病具有重要意义。 脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是水解甘油三酯的关键限速酶，与 As性心脑血管疾病密切相关。越来越多的研究显示，特异性敲除apoE-/-小鼠或As模型兔巨噬细胞中LPL，可以明显改善该小鼠或兔主动脉壁上脂质沉积和As斑块面积，提示巨噬细胞源性 LPL主要发挥致As作用。一方面，巨噬细胞LPL能通过促进脂质摄取而引起细胞内脂质过度蓄积。另一方面，巨噬细胞LPL还上调各种炎症因子表达。研究者们正努力寻找调控因子直接抑制体内巨噬细胞LPL表达，为防治As性心脑血管疾病提供新的治疗策略。 MicroRNAs是一类长约18-22个核苷酸的内生性单链成熟非编码RNA，通过形成RNA诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC）与靶标基因mRNA的3’非翻译区（3’-untranslated regions，3’UTR）发生完全或不完全配对，进而促进 mRNA的切割降解和翻译受抑，在转录后水平调控靶标基因的表达，已经成为 As重要的防治靶标。miR-590位于人类基因组7号染色体长臂近端。目前研究发现，miR-590参与保护血管、调节脂质、预防心梗等作用，与 As性心脑血管疾病密切相关。在心血管疾病中miR-590表达下调，提示其可能是一种保护性microRNA，但具体机制尚未明了。 利用生物信息学分析，我们发现 miR-590恰好具有靶向调控 LPL的生物学基础。我们的预实验结果显示，过表达miR-590可以沉默THP-1巨噬细胞LPL mRNA和蛋白质的表达。因此我们提出“miR-590通过直接靶向结合LPL3’UTR，沉默其表达，进而抑制巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应，发挥抗As的工作假说”。 第一部分 miR-590对巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响 目的：观察过表达或抑制miR-590对巨噬细胞胞内脂质蓄积及培养基炎症因子水平的影响。 方法：培养人THP-1和小鼠RAW264.7单核细胞并诱导分化成巨噬细胞，分为4组：miR-590mimic转染组，mimic-negnative对照组，miR-590 inhibitor转染组和inhibitor-negnative对照组，实时定量 PCR结果检测各组miR-590的表达水平。采用油红O染色显示巨噬细胞脂质蓄积情况，HPLC法检测巨噬细胞内总胆固醇（total cholesterol，TC）、游离胆固醇（free cholesterol，FC）和胆固醇酯（cholesterolester,CE）的含量。ELISA检测巨噬细胞白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素1β（interleukin-1beta,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）和单核趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的表达。 结果：①巨噬细胞转染miR-590 mimic可显著增加miR-590的表达，转染miR-590 inhibitor可抑制miR-590的表达。②油红O染色法和HPLC法检测显示miR-590 mimic可显著降低巨噬细胞内脂滴体积、数量，减少胞内TC、FC和CE含量，miR-590 inhibitor则显著增加巨噬细胞内脂滴体积、数量，升高胞内TC、FC和CE含量。③ELISA结果显示miR-590 mimic可显著降低巨噬细胞IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的水平，而miR-590inhibitor促进巨噬细胞炎症因子的产生。 结论：① miR-590可抑制巨噬细胞脂质蓄积；②miR-590可抑制巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的分泌。 第二部分 miR-590通过靶向抑制LPL减少巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌 目的：探讨miR-590是否与LPL3’UTR靶向结合并抑制其表达；观察过表达或沉默LPL后，miR-590对巨噬细胞脂质蓄积及炎症因子分泌的作用及机制。 方法：利用多个microRNA公共数据库及在线软件分析预测各物种miR-590保守性、LPL3’UTR序列、miR-590靶标基因、miR-590与LPL靶标结合评分、结合位点、茎环结构及自由能。采用双荧光素酶报告基因法检测miR-590是否与LPL3’UTR具有靶向结合作用。人THP-1和小鼠RAW264.7巨噬细胞分为：miR-590mimic转染组，mimic-negnative对照组，miR-590 inhibitor转染组和inhibitor-negnative对照组，采用实时定量PCR和Western blot法检测LPL mRNA和蛋白水平。利用试剂盒检测了miR-590对巨噬细胞培养液中 LPL活性的影响。在人 THP-1巨噬细胞中采用siRNA干扰技术抑制内源性LPL或加入小牛LPL，油红O染色法观察miR-590 mimic或miR-590inhibitor对巨噬细胞中脂质蓄积情况的影响，采用HPLC法检测miR-590 mimic或miR-590inhibitor对细胞内TC、FC和CE含量的影响，并检测了miR-590对巨噬细胞表面负责脂质摄入的清道夫受体SRA1和CD36表达的影响。采用ELISA检测miR-590 mimic或miR-590inhibitor对细胞内IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1分泌的影响。此外，我们还检测了miR-590对人THP-1巨噬细胞中磷脂成份的影响。 结果：①生物信息学分析结果显示miR-590高度保守，在物种进化及靶标基因调控中起关键作用；多个靶标预测网站发现miR-590恰好具有靶向调控 LPL的生物学基础。②293T细胞转染 LPL野生型3’UTR报告基因后，miR-590mimic组双荧光素酶活性与其正常对照组相比明显降低，而miR-590 inhibitor组双荧光素酶活性相对值明显增加。③实时定量PCR和Western blot结果显示转染miR-590 mimic能下调人THP-1和小鼠RAW264.7细胞LPLmRNA和蛋白质表达，而miR-590 inhibitor增加巨噬细胞LPLmRNA和蛋白质表达。④miR-590 mimic能使人THP-1细胞和鼠RAW264.7细胞LPL活性下降，miR-590inhibitor则显著增加巨噬细胞LPL活性。⑤在miR-590 mimic转染基础上加入牛LPL可逆转miR-590 mimic降低巨噬细胞内脂质水平的趋势；miR-590 inhibitor转染基础上进行LPLsiRNA干扰则逆转miR-590 inhibitor增加巨噬细胞内脂质水平的趋势。⑥转染miR-590 mimic的巨噬细胞中清道夫受体SRA1和CD36 mRNA和蛋白表达明显下降，在miR-590 mimic组加入LPL可逆转此趋势；转染miR-590 inhibitor的巨噬细胞中SRA1和CD36 mRNA和蛋白表达明显增加，在miR-590 inhibitor组沉默LPL后可逆转此趋势。⑦在 miR-590 mimic转染基础上加入 LPL可逆转miR-590 mimic降低巨噬细胞内炎症因子分泌的趋势；miR-590 inhibitor基础上进行LPLsiRNA干扰则逆转miR-590 inhibitor增加巨噬细胞内炎症因子水平的趋势。⑧miR-590 mimic组lyso-PC水平下降，卵磷脂相对增加；而miR-590 inhibitor组lyso-PC水平上升，卵磷脂水平下降。miR-590 mimic加入LPL或miR-590 inhibitor沉默LPL两组lyso-PC的水平与对照组无统计学差异。 结论：① miR-590具有靶向作用人/鼠LPL的生物信息学基础，能够结合巨噬细胞LPL3’UTR；② miR-590可抑制巨噬细胞中LPLmRNA和蛋白质的表达；③miR-590通过靶向抑制LPL减少巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子的产生。 第三部分 miR-590对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变和体内炎症因子水平的影响 目的：观察miR-590对apoE-/-小鼠As病变、主动脉壁内脂质蓄积、血脂水平、炎症因子及LPL表达的影响。 方法：8周龄雄性apoE-/-小鼠采用高脂高胆固醇饮食喂养，并随机分为4组（每组15只）：miR-590 agomir group(AG)组、miR-590 scrambled agomir group(AG-Con)组、miR-590 antagomir group（AN）组、miR-590scrambled antagomir group(AN-Con)组。其中，在AG组或AN组中，以80 mg/kg/d剂量溶入0.2ml生理盐水中，行尾静脉注射，每4周注射一次。8周后处死动物，体视显微镜下观察血管 As形成情况；全自动生化分析仪检测甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平；苏丹Ⅳ染色和油红O染色观察主动脉和主动脉窦As病变处脂质蓄积情况；Masson氏染色法检测斑块胶原纤维面积；免疫荧光双标技术检测 LPL在斑块中与巨噬细胞共定位情况与表达；实时定量 PCR和Westernblot法检测小鼠主动脉组织和腹腔巨噬细胞LPL mRNA和蛋白质的表达；HPLC法检测apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞中脂质水平；实时定量PCR及Western blot检测了apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞SRA1和CD36的表达；ELISA法检测血清炎症细胞因子的表达。 结果：①主动脉体视显微镜观察和苏丹Ⅳ染色结果显示，miR-590AG组小鼠主动脉内斑块较AG-Con组显著减少，而miR-590AN组小鼠主动脉内斑块较 AN-Con组显著增加。②油红 O染色显示，与AG-Con组相比，AG组小鼠主动脉窦斑块脂质蓄积明显减少；与AN-Con组相比，AN组小鼠的主动脉窦处的病变脂质蓄积明显增加。③Masson三色染色结果显示，AG组小鼠主动脉窦病变胶原纤维含量较 AG-Con对照组显著减少；与AN-Con对照组相比，AN组小鼠的主动脉窦处的病变胶原纤维含量显著增加。④免疫荧光双标技术检测显示主动脉根部AS病变区LPL表达阳性区域与巨噬细胞表达丰富区域一致。与AG-Con对照组相比，miR-590AG组小鼠主动脉窦As病变中巨噬细胞LPL表达显著减少；与AN-Con对照组相比，miR-590AN组小鼠主动脉窦As病变中巨噬细胞LPL表达显著增加。⑤实时定量PCR和Western blot结果显示，miR-590AG组小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞 LPLmRNA和蛋白质表达较AG-Con组明显降低；miR-590AN组小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞LPLmRNA和蛋白质表达较AN-Con组明显升高。⑥全自动生化分析仪检测显示，miR-590AG组小鼠TG水平较AG-Con组升高，TC、LDL-C水平明显降低； miR-590 AN组小鼠TG水平较AN-Con组降低，TC、LDL-C水平明显升高。⑦HPLC结果显示，与 AG-Con对照组相比，miR-590AG组小鼠腹腔巨噬细胞脂质水平明显降低；与AN-Con对照组相比，miR-590AN组小鼠腹腔巨噬细胞中脂质水平显著升高。⑧实时定量PCR及Western blot结果显示，miR-590过表达后可明显降低apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞SRA1和CD36的表达，而抑制miR-590后，SRA1和CD36的表达升高。⑨采用ELISA法检测结果显示，与AG-Con对照组相比，miR-590AG组小鼠血浆IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平明显降低；与AN-Con对照组相比，miR-590AN组小鼠血浆炎症因子水平显著升高。 结论：① miR-590抑制apoE-/-小鼠As病变的发生发展；②miR-590抑制apoE-/-小鼠As病损、As斑块内的脂质蓄积、血浆脂质水平和炎症因子表达；③miR-590可能通过抑制巨噬细胞LPL延缓apoE-/-小鼠血管壁As的形成。 第四部分川陈皮素对apoE-/-小鼠miR-590/LPL水平及动脉粥样硬化病变的影响 目的：观察川陈皮素对THP-1巨噬细胞miR-590水平、LPL表达和apoE-/-鼠主动脉As病变、斑块脂质蓄积、血脂及血浆炎症因子水平的影响。 方法：培养THP-1巨噬细胞，以不同浓度（0，10，20，40，80μM）川陈皮素处理24 h或40μM川陈皮素处理不同时间（0，6，12，24，48h），Western blot检测川陈皮素处理对LPL蛋白质表达的影响。用40μM的川陈皮素孵育 THP-1巨噬细胞共孵育24h，实时定量 PCR检测川陈皮素对 THP-1巨噬细胞中 miR-590水平的影响。THP-1巨噬细胞转染miR-590 mimic/inhibitor，Western blot检测川陈皮素对巨噬细胞LPL蛋白质表达的影响；HPLC法和油红O染色观察川陈皮素对巨噬细胞脂质含量的影响；ELISA检测川陈皮素对细胞培养液中炎症因子分泌的影响。苏丹Ⅳ染色显示川陈皮素对主动脉内膜面 As病变面积的影响。油红O染色观察川陈皮素对apoE-/-小鼠主动脉窦脂质蓄积的影响。Masson染色观察川陈皮素对 apoE-/-小鼠主动脉窦 As斑块胶原纤维的影响。取小鼠新鲜血清，检测川陈皮素对各组apoE-/-鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平。ELISA法检测川陈皮素对apoE-/-小鼠血浆炎症因子水平的影响。采用Western blot检测川陈皮素对apoE-/-小鼠主动脉LPL蛋白表达的影响。 结果：①川陈皮素下调THP-1巨噬细胞LPL蛋白质表达，并呈剂量和时间依赖性；②PCR结果显示，川陈皮素明显上调THP-1巨噬细胞中miR-590水平；③巨噬细胞转染miR-590 mimic后明显增强川陈皮素抑制LPL表达的作用，转染miR-590 inhibitor后则减轻川陈皮素抑制LPL表达的作用；④HPLC检测和油红O染色显示川陈皮素减少THP-1巨噬细胞脂质含量，Nob（川陈皮素）+miR-590 mimic组巨噬细胞内脂质含量则更加减少，而Nob+miR-590 inhibitor组巨噬细胞内脂质水平有所增加，基本上达到对照组水平；⑤ELISA检测结果显示，相较于对照组，川陈皮素减少THP-1巨噬细胞内IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1炎症因子的分泌，Nob+miR-590 mimic组巨噬细胞分泌的炎症因子更加减少，而Nob+miR-590 inhibitor组巨噬细胞内炎症因子水平有所增加，与对照组水平无差异。⑥苏丹Ⅳ染色液染色显示与对照组相比，Nob组小鼠主动脉斑块面积明显减少；而Nob+AG组小鼠主动脉的斑块面积更为减少，Nob+AN组动物主动脉处的斑块面积有所增加；⑦油红O染色显示，Nob组实验动物主动脉窦处脂质蓄积较对照组明显减轻；而Nob+AG组动物主动脉窦处的脂质蓄积减少更为明显；Nob+AN组动物主动脉窦处的脂质蓄积有所增加；⑧Masson染色显示与对照组相比，Nob组实验动物主动脉窦处胶原纤维含量减少；而Nob+AG组动物主动脉窦处的病变区胶原纤维含量减少更为明显；而Nob+AN组动物主动脉窦处的病变区胶原纤维含量较Nob组实验动物有增加；⑨与对照组比较，Nob组动物的血浆HDL-C水平有所升高，TG、TC及LDL-C水平均明显降低；Nob+AG组动物的血浆HDL-C水平亦有所升高，TC及LDL-C水平降低较Nob组更为明显，TG水平无变化；而Nob+AN组动物的血浆HDL-C水平有所升高，与Nob组无差异，TG水平下降，TC及LDL-C水平较Nob组有所上升。⑩ELISA法检测结果显示，与对照组相比，Nob组实验动物血浆炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平减少；Nob+AG组实验动物血浆炎症因子分泌降低更为明显；而Nob+AN组实验动物血浆炎症因子分泌有所增加，与对照组水平无统计学差异。○11 Western blot检测显示，与对照组相比，Nob组小鼠主动脉LPL蛋白表达明显降低；Nob+AG组主动脉LPL蛋白表达降低更为明显；而Nob+AN组主动脉LPL蛋白表达有所增加。 结论：①川陈皮素抗 apoE-/-小鼠 As的作用与其抗炎和降脂功能有关；②川陈皮素可上调miR-590水平，降低巨噬细胞LPL的表达，减少As斑块形成。
脂蛋白脂酶;微小RNA-590;脂质蓄积;炎症因子;动脉粥样硬化
南华大学
博士
基础医学
尹卫东;唐朝克
2015
中文
R364;R543.5
182
2016-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）