鼻咽癌细胞中14-3-3σ相关miRNAs差异表达谱研究
[目的]通过miRNA芯片技术获得14-3-3σ（SFN）所调控的miRNAs差异表达谱；通过RT-PCR技术验证芯片结果的可靠性；生物信息学分析获得的miRNAs差异表达谱所涉及的信号通路；阐明 miRNA-SFN之间的调控机制在鼻咽癌中的作用。 [方法]构建14-3-3σ高表达的重组细胞系5-8F-14-3-3σ(+)以及对照组细胞系5-8F-14-3-3σ(-)。经过Western blot检测两组细胞中14-3-3σ蛋白表达水平，确定转染成功。收集细胞，提取RNA，检测总RNA纯度，通过miRNA芯片检测SFN所调控的miRNAs差异表达谱。miRanda软件分析了下调倍数最大的10个靶 miRNAs的热动力学稳定性分值（mirSVR）和序列保守性分值（PhastCons），确定SFN的靶miRNAs。通过miRwalk在线软件进行预测和分析SFN的靶miRNAs。结合基因芯片结果进行对比分析，找出SFN的靶miRNA。TargetScan在线软件预测靶miRNA和SFN的结合位点。对SFN的靶miRNA进行qRT-PCR验证，与芯片结果进行比较。生物信息学分析14-3-3σ相关 miRNAs表达谱涉及到的信号通路、生物学过程、分子功能及细胞组分，从中找出关键的信号通路。 [结果]1.Western blot检测5-8F-14-3-3σ(+)细胞中14-3-3σ蛋白的表达水平明显高于5-8F-14-3-3σ(-)和5-8F细胞，而5-8F-14-3-3σ(-)和5-8F两组间蛋白表达无明显差异。2. miRNA芯片检测5-8F-14-3-3σ(+)和5-8F-14-3-3σ(-)两个细胞系之间的差异miRNAs，获得14-3-3σ调控的miRNAs差异表达谱。miRNA芯片显示SFN高表达后有239个miRNAs差异表达，其中上调的miRNAs有58个，而下调的miRNAs有181个。3.10个下调差异倍数最大的miRNAs中，通过miRanda软件分析发现符合条件的miRNAs（mirSVR≤-0.1，PhastCons0.4~0.7）有2个。因此，miR-675，miR-4253可能是SFN的靶miRNA。4. SFN的靶miRNAs通过miRwalk在线软件进行预测和分析，结果发现：10个软件当中有6个软件同时预测到了miR-145和miR-220c可与SFN结合；有5个软件同时预测到了miR-597，miR-129-3p，miR-603，miR-769-3p，miR-431，miR-608，miR-766，miR-31，miR-532-3p，miR-675，miR-922，miR-329，miR-483-3p，miR-554，miR-642，miR-886-5p，miR-362-3p，miR-486-3p等18个miRNAs可与SFN结合。与基因芯片结果对比分析，发现，miR-675可能是SFN作用的靶miRNA。5. Targetscan软件预测miR-675与SFN结合的位点，发现该结合位点位于SFN基因226-232碱基，其结合的序列是5'-CCGCACC-3'与miR-675部分序列一致。miRNA通过结合到SFN基因的3`-UTR,调控SFN的表达，两者的结合具有特异性，进一步说明SFN可能是miR-675的可靠的作用靶基因。6.生物信息学分析发现，差异miRNAs调控的靶基因当中，涉及到的信号通路主要包括WNT、MAPK、TGF-β。7.RT-PCR验证 miR-675和miR-4253的表达水平，miR-675和miR-4253在5-8F-14-3-3σ(+)中表达量分别为对照组5-8F-14-3-3σ(-)的-3.458和-5.098倍，与基因芯片结果一致。表明基因芯片结果检测可靠。 [结论]1.获得了14-3-3σ调控的miRNAs表达谱，在鼻咽癌细胞中14-3-3σ表达增高后，上调的miRNAs有58个，下调的miRNAs有181个；2.生物信息学分析结果表明，14-3-3σ相关miRNAs表达谱涉及到的功能复杂，其中WNT、MAPK、TGF-β信号通路可能与鼻咽癌发生发展有关；3. miR-675能与14-3-3σ结合，是14-3-3σ的靶miRNA；SFN可能是miR-675的基因，miR-675-SFN相互调控在鼻咽癌发生发展中具有重要作用。
鼻咽癌;发病机制;miRNAs差异表达谱;14-3-3σ;生物信息学
南华大学
硕士
基础医学
黄卫国
2015
中文
R739.63
110
2016-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）