伤寒多糖结合疫苗的生物合成研究
伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subspecies enterica serotype Typhi）是引发人类急性肠道传染病伤寒的病原菌，具有强的侵袭性，产生内毒素，由粪-口途径传播。伤寒是一种以发热为主要表现的全身性疾病，曾在世界各地流行。随着生活卫生条件的改善和抗生素（特别是氯霉素）的使用，伤寒的发病率与其导致的死亡率在发达国家有大幅度的下降，而在亚非拉的一些发展中国家依旧是一个重要的公共卫生问题。伤寒的常规治疗方式是抗生素疗法，但抗生素的长期使用造成了伤寒菌多重耐药株的产生。而接种疫苗，是除了改善卫生条件之外最有效的预防和控制手段，目前在全球范围内广泛使用的是注射用 Vi多糖疫苗和口服的Ty21a活疫苗。 由于多糖疫苗属于非 T细胞依赖性抗原，免疫后不形成免疫记忆，产生的抗体主要是亲和力较低的IgM和IgG2，且不能在婴幼儿体内产生有效的免疫力，而将细菌的聚糖与适当的蛋白载体结合形成糖蛋白疫苗，属于T细胞依赖性抗原，能够产生更好、更长久的免疫保护效果。细菌中存在糖基化修饰、细菌蛋白糖基化过程与脂多糖的合成的相似性以及pgl基因簇具有糖基化底物蛋白功能的发现，使得O抗原与免疫蛋白载体在细菌体内结合成为了可能。 本文采用改进的λ-Red重组系统，成功构建了伤寒菌50096 waaL基因缺失株，同时利用低拷贝质粒成功构建了waaL回复株。对这野生株和新构建的缺失株、回复株进行脂多糖（LPS）银染实验，鉴定3株菌LPS表型，实验结果表明缺失waaL基因导致 LPS无法正常合成，在检测凝胶中未形成长串的梯状条带。接着，对所构建的菌株进行生理生化特征研究，结果表明waaL的缺失对菌的生长几乎没有影响。随后，向缺失株中导入含脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）蛋白糖基化途径中糖基转移酶的表达载体，以及改构的重组铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）外毒素 A（rEPAN29）的表达载体，使重组菌细胞内能够诱导合成以伤寒OPS为目标抗原、以rEPAN29为载体蛋白的伤寒OPS-rEPAN29糖蛋白复合物。随后对其进行了IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳以及双向电泳检验。检测结果显示，重组菌能表达伤寒 OPS-rEPAN29糖蛋白复合物，且其蛋白表达谱仅存在较小差异。最后对糖蛋白复合物进行了分离纯化与免疫原性评价，ELISA测定血清抗体滴度表明，rEPAN29做为载体蛋白能有效增加糖链的免疫原性，糖蛋白比单独的多糖能诱导产生更好的免疫应答。 该方法成功制备了伤寒O多糖结合疫苗，为糖蛋白疫苗的生产提供了新思路，理论上也适用于其他革兰氏阴性菌的疫苗研发。
伤寒沙门氏菌;生物合成;多糖结合疫苗;免疫应答
吉首大学
硕士
生物学
彭清忠;王恒樑
2015
中文
R392.7;R516.3
56
2016-05-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）