超临界流体技术构建粗糙纳米纤维组织工程支架研究
组织工程支架是组织工程的基础，是组织工程技术的关键因素。支架的性能对于修复受损组织或重建功能具有重要的意义。目前传统方法如模压沥滤法等制备组织工程支架存在操作条件复杂，有机溶剂残留量高，孔洞贯通性差或需要盐析法除去固体致孔剂，负载的生长因子容易失活，同时无法获得与天然细胞外基质相类似的微观纳米拓扑结构等缺点。为克服上述缺点，本研究旨在利用超临界二氧化碳相转化技术，使用碳酸氢铵颗粒和左旋薄荷醇作为双重致孔剂，制备出具有粗糙表面的左旋聚乳酸纳米纤维组织工程支架。此外，探讨聚乳酸支架的生物相容性、不同拓扑结构与细胞相互作用以及对前成软骨细胞C5.18体外成软骨分化潜能的影响。本论文主要包括以下几方面内容： 1.聚乳酸纳米纤维组织工程支架的制备及结构表征 通过 Minitab实验设计，考察碳酸氢铵颗粒尺寸、薄荷醇/聚乳酸质量比以及聚乳酸浓度对支架孔隙率和压缩强度的影响。实验结果表明，在一定的聚合物浓度下，选择合适薄荷醇/聚乳酸质量比，获得的支架具有较高的压缩强度和孔隙率。考察超临界二氧化碳相分离过程中，压力、温度、聚合物浓度以及薄荷醇/聚乳酸质量比等工艺参数对支架形貌的影响。实验发现，通过改变操作压力，可以有效地控制聚合物溶液的分相过程，从而获得具有不同微观纳米拓扑结构的组织工程支架。在合适的压力条件（15 MPa）下，促进聚合物溶液的液-液分相和固-液分相，从而成功制备出具有粗糙表面的纳米纤维支架。操作温度及聚合物浓度对支架形貌影响较小。致孔剂薄荷醇的存在改善了非溶剂的传质环境，有助于在聚合物固化过程中成孔，从而提高了纳米纤维间孔洞的贯通性。 气相色谱分析表明，经过超临界二氧化碳流体处理后，支架中致孔剂薄荷醇已经被去除完全，支架中有机溶剂二氧六环残留量小于3 ppm，远低于 USP467药典的要求（380 ppm），这体现了超临界相转化技术的独特优势。通过原子力显微镜进一步表征了纳米纤维表面的微观结构。差示扫描量热、衰减全反射傅里叶红外光谱和广角 X射线衍射分析证实，经过超临界二氧化碳相转化技术处理后，促进了聚乳酸在结晶过程中发生再结晶现象；同时薄荷醇的存在导致在相分离过程中，聚乳酸的α-型与α'-型晶体发生转化。 2.聚乳酸支架生物相容性研究 使用L929细胞作为实验细胞模型进行细胞毒性实验，进行Alamar Blue和吖啶橙/溴化乙啶染色，实验结果表明，各实验组中细胞相对增殖率大于80％，制备出的支架细胞毒性较低，属于合格水平。急性全身毒性实验结果表明，小鼠经腹腔注射支架浸提液后，生长状况良好，生命活动正常，说明制备的支架材料为无毒材料。细胞溶血实验结果表明，支架材料溶血率均低于1.5%，具有良好的血液相容性。 3.聚乳酸组织工程支架表面拓扑结构与细胞相互作用研究 选择三种具有不同结构特征的支架，考察具有不同拓扑结构的支架对蛋白吸附、细胞粘附、增殖以及细胞分泌蛋白情况的影响。蛋白吸附实验结果表明，具有粗糙表面的纳米纤维支架能够提高纳米纤维的比表面积，为蛋白的吸附提供了更多的结合位点，有利于蛋白质的吸附。细胞粘附实验结果表明，在相同的接种时间内，纳米纤维支架能够更快的促进细胞的粘附，接种7小时后，细胞的粘附率为94%，高于其他实验组。细胞增殖及细胞分泌蛋白质实验结果表明，不同拓扑结构支架均具有良好的生物相容性，适合细胞的生长和增殖。特别地，纳米纤维支架由于其具有与天然细胞外基质相类似的结构特征，能够为细胞的生存提供更合适的微环境。 4.体外评价C5.18细胞在聚乳酸组织工程支架上的成软骨分化潜能 通过诱导 C5.18成软骨分化条件的考察，证明成软骨诱导液中地塞米松浓度为10-6 M时，能够更好地促进细胞的成软骨分化。在相同的诱导条件下，进一步考察具有不同拓扑结构的支架对 C5.18细胞成软骨分化潜能的差异。实验结果表明，在各实验组支架上细胞分布均匀。特别地，在纳米纤维组支架上细胞出现了团聚现象。随着诱导时间的延长，培养7天后，C5.18细胞在各组支架上分泌糖胺聚糖、胶原蛋白等细胞外基质成分的能力呈现出显著性差异。C5.18细胞在纳米纤维支架上具有最高的表达量。
超临界流体;聚乳酸;纳米纤维;粗糙表面;组织工程支架;生物相容性
华侨大学
硕士
生物化工
陈爱政
2015
中文
R318.08;TB383
95
2016-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）