天葵提取物抗晶状体氧化损伤的作用及其机制研究
目的: 本研究采用过氧化氢（H2O2）诱导人晶状体上皮细胞（Human Lens epithelial cell,HLEC）SRA01/04系损伤，建立SRA01/04细胞氧化损伤模型，探讨天葵提取物对过氧化氢损伤的人晶状体上皮细胞SRA01/04系的保护作用，并探讨其机制。 方法: 本研究采用过氧化氢（H2O2）与人晶状体上皮细胞（Human Lens epithelial cell,HLEC）SRA01/04系共同孵育以复制氧化损伤模型，再分别采用六种方法提取的天葵提取物对氧化损伤的人晶状体上皮细胞SRA01/04系进行干预，筛选出药物的最佳提取方法及有效浓度，从氧化损伤及细胞凋亡的角度进一步探讨中药天葵提取物治疗白内障的细胞及分子机制。(1)四甲基偶氮唑蓝法（methyl thiazolyl tetrazoliun,MTT）测定不同提取方法，不同浓度的天葵提取物对氧化损伤的人晶状体上皮细胞 SRA01/04系增殖的抑制作用,筛选出药物的最佳提取方法及浓度；（2）倒置显微镜下细胞形态学观察；(3)化学比色法检测天葵提取物对人晶状体上皮细胞 SRA01/04系内总超氧化物歧化酶（T-SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-px）,过氧化氢酶（Catalase,CAT）的活性及总抗氧化能力（T-AOC），脂质过氧化物丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量的影响；(4)透射电子显微镜观察天葵提取物对人晶状体上皮细胞SRA01/04系细胞凋亡形态的影响；(5)流式细胞仪（flow cytometer,FCM）检测人晶状体上皮细胞SRA01/04系内的线粒体跨膜电位（mitochondria membrane potential,ΔΨm）的影响；(6)流式细胞仪（flow cytometer,FCM）AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测天葵提取物对SRA01/04凋亡率及细胞周期的影响；(7)Western Blotting检测天葵提取物对SRA01/04内Bcl-2，Bax-2蛋白的表达的影响；(8)比色法检测天葵提取物对SRA01/04细胞中caspase-3、caspase-9活性的影响。 结果： 1.MTT结果显示模型组人晶状体上皮细胞SRA01/04系吸光度值比正常细胞对照组显著降低（P＜0.05）。六种方法提取的不同浓度的天葵干预的SRA01/04吸光度值均比模型组明显升高，细胞存活率分别为：TK甲醇(53.05±12.03)％，TK酒精(69.42±10.94)%,TK甲醇-乙酸乙酯(64.25±3.74)%,TK正丁醇(89.43±12.58)%，TK甲醇-正丁醇(71.23±6.02)%,TK水(78.45±3.80)%；其中TK正丁醇及TK水的保护效果较明显,与模型组比较有显著性差异（P＜0.05)。 2.倒置显微镜观察结果显示，SRA01/04在经过H2O2处理后，死亡率增加，生长受到抑制，而用天葵对细胞进行干预后，SRA01/04细胞形态接近正常细胞对照组组细胞的状态。 3.化学比色法检测氧化指标结果显示，与正常细胞对照组相比，模型组T-SOD、GSH-px、CAT、T-AOC活性均显著降低，而TK组T-SOD、GSH-px、CAT、T-AOC活性与模型组相比均升高（P＜0.05）；模型组MDA含量比正常组显著升高，TK组MDA含量比模型组均降低（P＜0.05）。 4.透射电子显微镜观察结果显示：正常细胞组细胞膜完整，表面有较多的微绒毛，胞浆内线粒体丰富，内质网、核糖体丰富。模型组出现明显的细胞凋亡的形态改变：细胞核固缩，核内染色质凝集成块分布于核膜下，尚可见少量细胞胞膜残缺不全。药物组细胞呈现轻微的细胞凋亡形态改变。 5.流式细胞仪检测线粒体跨膜电位结果显示，模型组线粒体跨膜电位（53.71±7.40）比正常细胞对照组（76.03±8.12）显著下降（P＜0.05），药物高中低剂量组的线粒体跨膜电位（75.76±10.41）、（74.44±9.84）、（58.35±7.64）与模型组比较显著升高（P＜0.05）。 6.流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期结果显示：①模型组(19.14±3.14）%凋亡率比正常细胞组（2.54±0.39）%显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05）；除天葵高剂量组凋亡率（12.66±1.35）%与模型组比较显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），天葵中、低剂量组（16.25±2.38）%，（17.17±2.68）%与模型组相比无统计学意义。②同时结合流式细胞周期图对DNA倍体进行分析的结果，模型组DNA含量比对照组显著下降，天葵药物组核内的DNA含量与模型组比较显著升高（P＜0.05）。 7.Western Blotting检测结果显示，正常细胞对照组人晶状体上皮细胞中均表达一定量的Bcl-2和Bax蛋白，模型组细胞的Bcl-2蛋白表达量下降，Bax蛋白表达量升高，Bcl-2/Bax比率下降。天葵药物组可明显上调 Bcl-2的表达量，下调Bax的表达量(与模型组相比，p值均＜0.05），Bcl-2/Bax比率上升。 8.比色法检测 caspase-3、caspase-9的活性结果显示：模型组 caspase-3、caspase-9活性比正常组显著升高(P＜0.05），而药物组caspase-3 caspase-9活性比模型组降低(P＜0.05）。 结论： 1. H2O2可引起人晶状体上皮细胞SRA01/04系发生氧化损伤。天葵提取物对晶状体上皮细胞 SRA01/04系的氧化损伤具有保护作用，其保护作用可能与提高SRA01/04内抗氧化酶T-SOD、CAT、GSH-px、T-AOC的活性，降低MDA含量有关。 2. H2O2可引起人晶状体上皮细胞SRA01/04系凋亡。天葵提取物可减轻H2O2引起的人晶状体上皮细胞SRA01/04系凋亡，其机制可能与提高线粒体跨膜电位、上调Bcl-2蛋白的表达、下调Bax蛋白的表达，以及抑制caspase-3和caspase-9的活性有关。
天葵提取物;白内障;人晶状体上皮细胞;氧化损伤;细胞凋亡
贵阳医学院
硕士
药理学
宛蕾;梁冰
2013
中文
R285.5;R276.7
71
2016-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）