△4/△15脂肪酸去饱和酶在哺乳动物细胞的表达及功能研究
目的： 实现原生动物小眼虫Euglena gracilis的△4去饱和酶基因sD4在哺乳动物CHO细胞中表达，发挥△4去饱和酶活性；与线虫C.Briggsae的△15去饱和酶基因sN3协同作用：在CHO细胞中，这两种基因共同作用，只需要在培养基中添加亚油酸和花生四烯酸作为底物就能合成高含量的DHA、EPA等ω-3PUFAs。 方法： 首先将小眼虫Euglena gracilis的△4去饱和酶基因sD4经过密码子优化，人工合成后连接到pcDNA3.1(-)哺乳动物高效表达载体上。同时构建pcDNA3.1-sN3sD4双基因表达载体。然后用脂质体法瞬时转染CHO细胞。最后采用RT-PCR检测基因在mRNA水平的表达，用GC-MS检测细胞总脂肪酸含量来鉴定sN3和sD4基因的功能。 结果： 成功构建pCDNA3.1-sD4以及pCDNA3.1-sN3sD4高效表达载体；将这二个高效表达载体成功转染哺乳动物CHO细胞；sD4基因在CHO细胞中成功表达，发挥△4去饱和酶活性，将DPA转变成DHA，与对照组相比合成能力显著提高。同时，sD4基因能与sN3基因协同作用，利用△15去饱和酶作用积累的DPA合成高水平的DHA。 结论： pCDNA3.1-sD4基因高效表达载体以及双基因表达载体pCDNA3.1-sN3sD4的成功构建，并实现在哺乳动物CHO细胞中的表达，合成高含量的DHA、EPA。为下一步转基因动物制作以及DHA在临床和保健产业的应用打下了坚实的基础。
哺乳动物;△4去饱和酶;△15去饱和酶;pCDNA3.1-sD4基因;CHO细胞
佳木斯大学
硕士
生物化学与分子生物学
张涛
2013
中文
Q783
48
2016-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）