慢病毒ShRNA干扰PGC-1α表达在DR中的作用
目的： 本研究通过检测在 AGEs环境中人脐静脉内皮细胞株 EA.hy926、RPE细胞株ARPE-19以及DM大鼠视网膜中PGC-1α、VEGF、及EGR-1的表达变化，探究PGC-1α在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用，及PGC-1α、VEGF与EGR-1间的关系，为DR的发生发展及治疗提供一定理论依据。 方法： 确定PGC-1αsi-RNA序列：sense,5‘-AAGACGGAUUGCCCUCAUUUGtt-3‘;antisense,5‘-CAAAUGAGGGCAAUCCGUCUUtt-3‘。合成含 PGC-1α序列的单链DNA，然后退火配对产生双链，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子后，送测序验证，测序结果经比对确认正确的克隆即为构建成功PGC-1α RNAi慢病毒载体。 取生长状态良好的内皮细胞与RPE细胞，经AGEs(1g/L)干预4d后，加入慢病毒包装的PGC-1αShRNA感染后，分普通培养液培养及AGEs持续培养，具体实验分组如下：A.普通培养液培养；B. AGEs培养（1g/L）；C. AGEs培养4天后PGC-1αRNA干扰1.继而更换正常培养液培养；2.持续 AGEs（1g/L）培养。检测慢病毒对内皮细胞、RPE细胞的感染率。采用免疫细胞化学检测各组细胞PGC-1α、VEGF及EGR-1的表达情况。提取细胞总RNA，应用RT-PCR检测PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量，进行数据归纳和统计学分析。 SD大鼠腹腔注射STZ制作糖尿病模型。对DM大鼠行玻璃体腔注射慢病毒包装的PGC-1α shRNA，具体实验分组：A.正常组（10只）B.糖尿病组（1.糖尿病4W组（10只）2.糖尿病8W组（10只）） C. RNAi组（1. DM4周玻璃体腔注射PGC-1α干扰RNA10天后取材（10只）2. DM8周玻璃体腔注射PGC-1α干扰RNA10天后取材（10只））。 观察大鼠玻璃体腔转染情况：玻璃体腔注射一周后，行眼球冰冻切片，荧光显微镜下观察 shRNA慢病毒对视网膜转染情况。采用免疫组织化学检测各组大鼠视网膜PGC-1α、VEGF及EGR-1的表达情况。提取大鼠视网膜总RNA，应用RT-PCR检测PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量，进行数据归纳和统计学分析。 结果： 阳性重组子测序结果序列比对完全正确，表明靶向PGC-1α的RNA干扰慢病毒制备成功。靶向PGC-1α的慢病毒ShRNA转染293T细胞2天后，在荧光显微镜下观察同一视野的荧光和可见光照片，可见慢病毒转染率高达95％以上。 在MOI=100 polybreen（+）时内皮细胞和RPE细胞感染效果好，感染率达80%—85%。免疫细胞化学与实时荧光PCR检测结果显示在正常内皮细胞与RPE细胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表达，内皮细胞与RPE细胞在AGEs培养后PGC-1α、VEGF与EGR-1在蛋白及mRNA水平升高，组间差异有统计学意义（p<0.05）；在使用慢病毒ShRNA干扰PGC-1α后更换普通培养液培养，PGC-1α、VEGF与EGR-1均较AGEs培养后下降（p<0.05）；继续使用AGEs培养，PGC-1α、VEGF与EGR-1表达虽比AGEs培养组下调（p<0.05），但仍较更换普通培养液组升高（p<0.05）。 玻璃体腔注射后视网膜转染率高，荧光显微镜下观察显示高荧光。免疫组织化学与实时荧光PCR检测结果显示糖尿病组PGC-1α、VEGF与EGR-1较正常组在蛋白及mRNA水平升高，组间差异有统计学意义（p<0.05），且PGC-1α和VEGF的表达均随病程进展而表达增加。RNAi组 PGC-1α蛋白及 mRNA水平均较糖尿病组下降（p<0.05），VEGF与EGR-1在玻璃体腔注射慢病毒ShRNA干扰PGC-1α后较同病龄糖尿病组未见明显改变。 结论： 1.在正常内皮细胞与RPE细胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表达，AGEs环境下内皮细胞与RPE细胞中PGC-1α、EGR-1及VEGF表达均明显升高。 2.使用PGC-1αSh-RNA慢病毒转染经干预AGEs过的细胞后，细胞中PGC-1α在蛋白与mRNA水平表达均下调至正常水平，同时EGR-1和VEGF在蛋白与mRNA水平表达也下调至正常水平。可见PGC-1α与EGR-1、VEGF在内皮细胞与RPE细胞中表达存在正相关。 3.即使经PGC-1αSh-RNA慢病毒干扰，但若内皮细胞与RPE细胞仍持续处于AGEs环境中，PGC-1α、VEGF与EGR-1表达虽较AGEs培养组下调，但仍无法回归到正常水平，推断因AGEs的堆积造成“代谢记忆”。 4.在DM大鼠视网膜中PGC-1α、EGR-1及VEGF表达均明显上调，且PGC-1α与VEGF的表达随DM病程进展而增加。 5.在对DM大鼠进行RNA干扰后，大鼠视网膜中PGC-1α较同病龄的DM大鼠下调，但EGR-1和VEGF与同病龄的DM大鼠比较无明显变化。推测因体内环境复杂，DM发生后在多信号通路启动及“代谢记忆”产生的情况下，EGR-1及VEGF表达无法回到正常水平。
糖尿病视网膜病变;PGC-1α表达;RNA干扰技术;发病机制;体内环境
福建医科大学
硕士
眼科学
黄焱
2015
中文
R587.2;R774.1
68
2016-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）