慢病毒ShRNA干扰PGC-1α表达在DR中的作用
目的: 本研究通过检测在 AGEs环境中人脐静脉内皮细胞株 EA.hy926、RPE细胞株ARPE-19以及DM大鼠视网膜中PGC-1α、VEGF、及EGR-1的表达变化,探究PGC-1α在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用,及PGC-1α、VEGF与EGR-1间的关系,为DR的发生发展及治疗提供一定理论依据。 方法: 确定PGC-1αsi-RNA序列:sense,5‘-AAGACGGAUUGCCCUCAUUUGtt-3‘;antisense,5‘-CAAAUGAGGGCAAUCCGUCUUtt-3‘。合成含 PGC-1α序列的单链DNA,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆即为构建成功PGC-1α RNAi慢病毒载体。 取生长状态良好的内皮细胞与RPE细胞,经AGEs(1g/L)干预4d后,加入慢病毒包装的PGC-1αShRNA感染后,分普通培养液培养及AGEs持续培养,具体实验分组如下:A.普通培养液培养;B. AGEs培养(1g/L);C. AGEs培养4天后PGC-1αRNA干扰1.继而更换正常培养液培养;2.持续 AGEs(1g/L)培养。检测慢病毒对内皮细胞、RPE细胞的感染率。采用免疫细胞化学检测各组细胞PGC-1α、VEGF及EGR-1的表达情况。提取细胞总RNA,应用RT-PCR检测PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量,进行数据归纳和统计学分析。 SD大鼠腹腔注射STZ制作糖尿病模型。对DM大鼠行玻璃体腔注射慢病毒包装的PGC-1α shRNA,具体实验分组:A.正常组(10只)B.糖尿病组(1.糖尿病4W组(10只)2.糖尿病8W组(10只)) C. RNAi组(1. DM4周玻璃体腔注射PGC-1α干扰RNA10天后取材(10只)2. DM8周玻璃体腔注射PGC-1α干扰RNA10天后取材(10只))。 观察大鼠玻璃体腔转染情况:玻璃体腔注射一周后,行眼球冰冻切片,荧光显微镜下观察 shRNA慢病毒对视网膜转染情况。采用免疫组织化学检测各组大鼠视网膜PGC-1α、VEGF及EGR-1的表达情况。提取大鼠视网膜总RNA,应用RT-PCR检测PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量,进行数据归纳和统计学分析。 结果: 阳性重组子测序结果序列比对完全正确,表明靶向PGC-1α的RNA干扰慢病毒制备成功。靶向PGC-1α的慢病毒ShRNA转染293T细胞2天后,在荧光显微镜下观察同一视野的荧光和可见光照片,可见慢病毒转染率高达95%以上。 在MOI=100 polybreen(+)时内皮细胞和RPE细胞感染效果好,感染率达80%—85%。免疫细胞化学与实时荧光PCR检测结果显示在正常内皮细胞与RPE细胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表达,内皮细胞与RPE细胞在AGEs培养后PGC-1α、VEGF与EGR-1在蛋白及mRNA水平升高,组间差异有统计学意义(p<0.05);在使用慢病毒ShRNA干扰PGC-1α后更换普通培养液培养,PGC-1α、VEGF与EGR-1均较AGEs培养后下降(p<0.05);继续使用AGEs培养,PGC-1α、VEGF与EGR-1表达虽比AGEs培养组下调(p<0.05),但仍较更换普通培养液组升高(p<0.05)。 玻璃体腔注射后视网膜转染率高,荧光显微镜下观察显示高荧光。免疫组织化学与实时荧光PCR检测结果显示糖尿病组PGC-1α、VEGF与EGR-1较正常组在蛋白及mRNA水平升高,组间差异有统计学意义(p<0.05),且PGC-1α和VEGF的表达均随病程进展而表达增加。RNAi组 PGC-1α蛋白及 mRNA水平均较糖尿病组下降(p<0.05),VEGF与EGR-1在玻璃体腔注射慢病毒ShRNA干扰PGC-1α后较同病龄糖尿病组未见明显改变。 结论: 1.在正常内皮细胞与RPE细胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表达,AGEs环境下内皮细胞与RPE细胞中PGC-1α、EGR-1及VEGF表达均明显升高。 2.使用PGC-1αSh-RNA慢病毒转染经干预AGEs过的细胞后,细胞中PGC-1α在蛋白与mRNA水平表达均下调至正常水平,同时EGR-1和VEGF在蛋白与mRNA水平表达也下调至正常水平。可见PGC-1α与EGR-1、VEGF在内皮细胞与RPE细胞中表达存在正相关。 3.即使经PGC-1αSh-RNA慢病毒干扰,但若内皮细胞与RPE细胞仍持续处于AGEs环境中,PGC-1α、VEGF与EGR-1表达虽较AGEs培养组下调,但仍无法回归到正常水平,推断因AGEs的堆积造成“代谢记忆”。 4.在DM大鼠视网膜中PGC-1α、EGR-1及VEGF表达均明显上调,且PGC-1α与VEGF的表达随DM病程进展而增加。 5.在对DM大鼠进行RNA干扰后,大鼠视网膜中PGC-1α较同病龄的DM大鼠下调,但EGR-1和VEGF与同病龄的DM大鼠比较无明显变化。推测因体内环境复杂,DM发生后在多信号通路启动及“代谢记忆”产生的情况下,EGR-1及VEGF表达无法回到正常水平。
糖尿病视网膜病变;PGC-1α表达;RNA干扰技术;发病机制;体内环境
福建医科大学
硕士
眼科学
黄焱
2015
中文
R587.2;R774.1
68
2016-05-04(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)