脊髓趋化因子受体CXCR3介导骨癌痛发生和维持的机制
由于环境污染的加剧，特别是雾霾、重金属污染的流行，禁烟运动的失败，以及食品卫生造假贩假的猖獗等诸多因素，我国公民身心健康受到严重的威胁，随之而来的是乳腺癌、肺癌、前列腺癌症的高发化与年轻化。乳腺癌、肺癌、前列腺癌具有极高的骨转移性，而骨癌痛（bone cancer pain，BCP）则成为其常见的并发症。 由于 BCP的发生机制尚未研究明了，目前临床上缺乏治疗 BCP的有效方法，因此广大患者正在饱受着BCP的摧残。所以，深入研究BCP的发病机制，为研发有针对性的治疗药物和治疗手段提供理论依据显得迫在眉睫。 目前发现的20余种趋化因子受体可被分为C、CC、CXC、CX3C四种类型。近年来的研究证实，趋化因子家族广泛参与疼痛的调节，包括 BCP。如 CCL2、CCL5等在骨癌痛模型中显著上调；抑制趋化因子受体 CX3CR1可减轻 BCP。CXCR3属于 CXC类型趋化因子受体之一，本课题组前期基因芯片研究证实，BCP大鼠脊髓腰膨大部位CXCL10/ CXCR3显著上调，并且证实CXCL10/ CXCR3通过激活小胶质细胞介导BCP的发生。但是具体的外周与中枢的细胞、分子机制尚未阐明。 Akt作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）的主要下游信号分子。Akt在细胞功能的调控中具有相当重要的作用。如诸多的研究证明，Akt的活化参与细胞存活与凋亡的调控；更重要的是，Akt广泛表达于脊髓，特别是脊髓背角I-IV板层，参与各种刺激引起的痛觉过敏。CXCR3属于G蛋白偶联受体（Guanosine-binding protein coupled receptors，GPCRs）家族。PI3K通路受GPCRs（包括趋化因子受体）调控。并且CXCR3的上调可激活Akt。因此我们猜测，脊髓水平PI3K的下游Akt可能作为CXCR3的下游，参与介导BCP的发生和维持。 胞外信号调节酶（Extracellular signal-regulated kinases，ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族成员之一，可以把一系列胞外信号信息传递到细胞内。如 ERK信号通路在突触和神经元可塑性上发挥着重要作用。并且 ERK广泛参与调节各种伤害性刺激和伤害性信息所诱导的外周、中枢神经敏感化。CXCR3的上调可激活 ERK。因此我们猜测，脊髓水平 ERK可能作为 CXCR3的下游，参与介导BCP的发生与维持。 PI3K/ Akt与Raf/ MEK/ ERK之间存在相互调节关系。假如Akt与ERK同时作为CXCR3的下游介导 BCP的发生，那么 BCP条件下两者间也可能存在相互调节(crosstalk)。 因此，本研究拟通过western blot、免疫荧光、神经药理学与行为学相结合的方法，深入研究 CXCR3参与 BCP具体的细胞、分子机制，为研发有针对性的治疗药物和治疗手段提供理论依据。 研究方法和结果 一、CXCR3在骨癌痛发生发展中的作用 方法：实验一、采用western blot及免疫荧光方法研究BCP发生过程中脊髓水平CXCR3表达时间相与分布，及 CXCR3与神经元、胶质细胞共表达情况；实验二、采用免疫荧光方法研究BCP发生过程中DRG水平CXCR3表达时间相，及与肽能、非肽能神经元和A型神经元共表达情况；实验三、研究 CXCR3特异性抑制剂 AMG487预处理及后处理对BCP机械痛阈的影响。 结果：BCP模型建立后，脊髓水平 CXCR3呈时间依赖性升高，并表达分布于脊髓背角 I-V板层，且与脊髓神经元（NeuN标记）、星形胶质细胞（GFAP标记）和小胶质细胞（IBA1）共表达； DRG水平CXCR3呈时间依赖性升高，并与非肽能神经元（IB4标记）、A型神经元（NF200标记）及肽能神经元（CGRP标记）共表达； CXCR3抑制剂AMG487预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。 二、Akt依赖CXCR3活化介导骨癌痛的发生和维持 方法：实验一、采用western blot及免疫荧光方法研究BCP发生过程中脊髓水平pAkt表达时间相及分布；实验二、采用免疫荧光方法研究 BCP发生过程中脊髓水平pAkt表达分布及与CXCR3共表达情况；实验三、采用western blot方法研究CXCR3抑制剂AMG487对BCP诱发的pAkt表达上调的影响；实验四、研究Akt上游PI3K抑制剂wortmannin预处理及后处理对BCP机械痛阈的影响。 结果：BCP模型建立后，脊髓水平 pAkt呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角I-V板层；脊髓pAkt与CXCR3存在共表达；AMG487明显抑制BCP引起的pAkt上调；PI3K抑制剂wortmannin预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。 三、ERK依赖CXCR3活化介导骨癌痛的发生和维持 方法：实验一、采用western blot及免疫荧光方法研究BCP发生过程中脊髓水平pERK1/2表达时间相及分布；实验二、采用免疫荧光方法研究 BCP发生过程中脊髓水平pERK1/2表达分布及与CXCR3共表达情况；实验三、采用western blot方法研究CXCR3抑制剂AMG487对BCP诱发的pERK1/2表达上调的影响；实验四、研究ERK上游MEK抑制剂U0126预处理及后处理对BCP机械痛阈影响。 结果：BCP模型建立后，脊髓水平pERK1/2呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角 I-V板层；脊髓 pERK1/2与 CXCR3存在共表达；AMG487明显抑制 BCP引起的pERK1/2上调；MEK抑制剂U0126预处理或后处理分别地显著预防或逆转双侧机械痛阈。 四、Akt与ERK相互调控介导骨癌痛的发生和维持 方法：实验一、研究鞘内注射PI3K抑制剂wortmannin对骨癌痛诱发的pAkt表达上调的影响；实验二、研究鞘内注射 PI3K抑制剂 wortmannin对骨癌痛诱发的pERK1/2表达上调的影响；实验三、研究鞘内注射 MEK抑制剂 U0126对骨癌痛诱发的 pERK1/2表达上调的影响；实验四、研究鞘内注射 MEK抑制剂 U0126对骨癌痛诱发的pAkt表达上调的影响。 结果：鞘内注射PI3K抑制剂wortmannin可抑制骨癌痛诱发的pAkt表达上调；鞘内注射 PI3K抑制剂 wortmannin可抑制骨癌痛诱发的 pERK1/2表达上调；鞘内注射MEK抑制剂 U0126可抑制骨癌痛诱发的 pERK1/2表达上调；鞘内注射 MEK抑制剂U0126可抑制骨癌痛诱发的pAkt表达上调。 五、统计学处理 所有数据使用均数±标准误表达。计量资料两两比较使用t-检验。多组间比较使用单因素方差分析。行为学比较采用双因素方差分析，时间为组内因素，处理为组间因素。P<0.05认为差异有统计学意义。 研究总结 一、主要研究结果 1、BCP模型建立后，脊髓水平 CXCR3呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角 I-V板层，且与脊髓神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞共表达；DRG水平 CXCR3呈时间依赖性升高，并与非肽能神经元、A型神经元及肽能神经元共表达；CXCR3抑制剂AMG487预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。 2、BCP模型建立后，脊髓水平 pAkt呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角 I-V板层；pAkt与 CXCR3存在共表达；AMG487抑制 BCP引起的 pAkt上调；PI3K抑制剂wortmannin预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。 3、BCP模型建立后，脊髓水平pERK1/2呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角I-V板层；pERK1/2与CXCR3存在共表达；AMG487抑制 BCP引起的 pERK1/2上调；MEK抑制剂U0126预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。 4、鞘内注射 PI3K抑制剂 wortmannin可抑制骨癌痛诱发的 pAkt及 pERK1/2表达上调；鞘内注射MEK抑制剂U0126可抑制骨癌痛诱发的pERK1/2及pAkt表达上调。 二、研究结论 1、脊髓水平趋化因子受体CXCR3参与介导骨癌痛的发生和维持。 2、脊髓水平趋化因子受体CXCR3通过调控下游Akt与ERK的活性介导骨癌痛的发和维持。 3、脊髓水平Akt与ERK之间的相互调控是CXCR3参与介导骨癌痛的发生与维持的分子机制。 三、展望 1、本研究证实了 CXCR3通过其下游分子 Akt与 ERK的活化相关机制参与介导BCP的发生和维持，但是CXCR3如何调控Akt与ERK的具体机制有待进一步研究。 2、本研究发现CXCR3表达分布于脊髓神经元与胶质细胞，因此我们猜测CXCR3介导 BCP的发生与维持可能涉及神经元与胶质细胞之间的相互影响，但其具体信号传递仍有待研究。 3、本研究证实脊髓 Akt、ERK两者之间的相互调节参与介导 BCP的发生发展，但是其细胞核内机制尚有待深入研究。
骨癌痛;CXC类趋化因子受体;磷脂酰肌醇3激酶;蛋白激酶B;胞外信号调节酶;发病机制
华中科技大学
博士
麻醉学
田玉科
2015
中文
R738.1;R730.6
113
2016-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）