C族GPCRs配体识别及标记研究
G蛋白偶联受体GPCRs是最大的一类膜受体家族，它能介导由激素，神经递质和感觉刺激等不同的细胞外配体所引发的细胞应答，是极其重要的药物靶点。mGluRs和GABAB受体属于GPCR C家族，它们在谷氨酸能及γ氨基丁酸能的神经突触中均有表达，在突触前或突触后水平上参与调控多种生理过程，并与神经分裂，抑郁，癫痫，痉挛以及药物成瘾等多种疾病的发生相关。和其他GPCRs相比，C族GPCR在七次跨膜核心结构之外有一个巨大的胞外结构域，其包含一个配体结合口袋（LBP）用于配体的识别和结合。 对GPCRs药理学特性的系统发育学研究表明，它们的配体识别位点在进化过程中存在保守性和变异性。保守性表现在不同种属来源的受体能够识别相同的内源性配体，而变异性表现为不同种属来源的受体识别相同配体后展现出不同的药理学特性，或是在配体识别位点发生了突变从而改变了对配体的识别能力。为了更好的研究受体对配体的识别机制及这种能力在进化过程中的保守与差异，开发具有种属间受体特异性的药物，有必要对不同种属来源的受体的配体识别与功能差异进行比较。mXR以及Dro-GABABR分别是mGluRs受体和GABAB受体在昆虫中的同源受体，对这两类受体的研究表明它们的配体识别位点在进化过程中出现了差异。本课题的第一部分我们克隆了几种昆虫中的mXR和果蝇中的Dro-GABABR，利用功能检测手段对不同化合物库中的药物进行了激动剂和拮抗剂的筛选，并通过对一种mXR的配体-LBP相互作用的分子对接和3D建模确认了mXR中配体与LBP的相互作用方式。 在GPCRs的功能研究中，由于抗体特异性较差，对于受体在活细胞中的标记一直是一大难题。基于此，在本课题第二部分的研究中，我们以配体和受体的特异性识别为原则，设计合成了以GABAB受体的配体CGP64213为母核的光亲和探针，该探针可以特异性的标记活细胞膜表面的GABAB受体。利用探针中的荧光标签联合一套有效的毛细管电泳单细胞蛋白分析装置可以在单个传代细胞或原代神经元中特标记并检测膜蛋白GABAB受体GB1亚基的各种剪切异构体。我们的结果在蛋白质水平上展示了单个的HEK293和MEF细胞中GB1和其它GB1剪切异构体的存在。同时还展现了不同细胞个体间GB1蛋白质表达谱的细胞异质性。 总而言之，我们的工作首先从进化的角度探究了不同种属间C族GPCRs对配体识别的差异性，然后我们利用特异性配体作为探针，在活细胞的膜表面标记GABAB受体并对其进行单细胞水平上的高灵敏和高分辨的检测。
G蛋白偶联受体;mGluRs;GABAB受体;药物靶点;配体识别位点;毛细管电泳
华中科技大学
博士
生物物理学
刘剑峰
2015
中文
R962;R965.1
125
2016-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）