牛黄参含药血清诱导人肝癌细胞HepG2凋亡及其分子机制研究
目的：在细胞和分子水平探讨牛黄参含药血清（NHS）诱导人肝癌细胞 HepG2凋亡及其可能的作用机制，为其在肝癌中的广泛应用提供实验基础和理论支持。 方法：结合细胞与血清药理学实验方法，对比空白血清、阳性药CTX、不同浓度组NHS含药血清对HepG2细胞凋亡及凋亡相关调控基因Cyclin D1、FAS及线粒体膜电位的影响。主要实验过程如下： 1．制备空白对照、CTX及NHS含药鼠血清，并体外培养人肝癌细胞HepG2。 2.用CCK-8法检查CTX及0％、5%、10%和20%NHS含药血清对HepG2细胞生长抑制率。 3．HepG2细胞给药48 h后，DAPI染色，荧光显微镜下观察细胞形态学变化。 4．HepG2细胞给药48 h后，凝胶电泳检测DNA ladder。 5．实时定量PCR检测NHS含药血清对HepG2细胞细胞周期蛋白Cyclin D1 mRNA表达的影响。 6．免疫组织化学和流式细胞术检测NHS含药血清对HepG2细FAS抗原表达的影响。 7．流式细胞术检测NHS含药血清对HepG2细胞线粒体膜电位的影响。 结果：1.成功制备NHS含药血清，随着NHS浓度的增加，HepG2细胞的生长明显受抑，20%NHS组其细胞抑制率和CTX组相当，差别无统计学差异；随着药物作用时间的延长，细胞生长受抑程度明显加重。 2.采用荧光显微镜检测DAPI染色的两组细胞可以发现，与空白对照组相比，20%NHS孵育48小时后，HepG2细胞核染色质明显固缩和碎裂，产生凋亡小体。 3．DNA Ladder检测提示HepG2细胞加入CTX和不同浓度的NHS后，与空白组相比均有连续的寡克隆带或多聚体的形成，浓度5%、10%和20%的NHS含药血清均具有和CTX基本一致的寡克隆带形成，表明其具有明显的促进细胞凋亡的作用。 4．随着 NHS浓度的逐步增加(5%NHS组、10%NHS组和20%NHS组)，Cyclin D1 mRNA的表达水平逐渐下降，而且20%NHS组的表达量与空白对照组相比，差别具有明显的统计学意义（P<0.05）。 5.免疫组化结果显示，与空白对照组相比，除 CTX组的细胞内棕黄色颗粒明显增多外，从5%到20%的NHS含药血清组，阳性细胞的比例明显增高，提示Fas的表达逐渐增强。与空白对照HepG2的Fas阳性细胞数（1.75±0.34）%相比，不同浓度的NHS含药血清（5%，10%，20%）孵育48小时后的Fas阳性细胞数分别为（6.54±0.98）%，（13.84±0.72）%和（27.03±2.01）%，与空白对照相比均有统计学意义(P<0.01),提示Fas蛋白表达升高具有明显的浓度依赖性，且20%NHS含药血清组与CTX组相比差别没有统计学意义。 6．NHS作用于HepG2细胞后48 h，，荧光强度随着NHS浓度升高而逐渐降低，提示线粒体膜电位水平降低。 结论：NHS含药血清具有诱导HepG2细胞凋亡的作用，其诱导凋亡的机制可能是通过下调细胞周期蛋白Cyclin D1表达，升高FAS表达水平及降低线粒体膜电位相关。
牛黄参;含药血清;肝癌;作用机制;动物模型;免疫组织化学
湖北中医药大学
博士
中医临床基础
赵映前
2015
中文
R735.7;R285.5
87
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）