NF-κB介导的炎性反应在模拟失重大鼠动脉重建中的作用
航天飞行时，暴露于微重力环境可导致航天员心血管系统发生功能与结构的适应性变化，当返回地面1G重力环境或受到其他立位应激时，普遍出现明显的心血管失调反应，主要表现为立位耐力不良和运动能力降低。近半个世纪以来，人们对航天后心血管失调的发生机理已取得一定认识，虽然尚需更多深入的研究工作予以全面阐明，但已有研究结果证实，动脉功能调整与结构重塑可能是航天飞行后立位耐力不良发生的主要机制之一。 微重力环境下，由于流体静压消失，全身动脉血管系统跨壁压及血液分布发生变化，与地面1G重力下直立体位时相比，人脑部动脉处于相对升高的“高血压”状态，而下身动脉则处于相对降低的“低血压”状态。近年来，地面模拟失重大鼠模型研究发现，动脉系统功能和结构呈现区域特异性改变：大鼠前身动脉血管发生肥厚性改变，血管收缩反应性增强；后身动脉发生萎缩性改变，血管收缩反应性减弱。另外，内皮依赖性舒张功能在模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和基底动脉均明显降低，提示模拟失重大鼠动脉内皮功能可能发生变化。在阐明流体静压改变引起动脉功能调整与结构重塑的机理时，我们和其他实验室均发现模拟失重大鼠局部肾素-血管紧张素系统（local rennin-angiotension system，L-RAS）在动脉系统亦呈现区域特异性改变：RAS主要成份，血管紧张素原和血管紧张素Ⅱ1型受体的基因和蛋白，在前身表达上调，而在后身表达下调。另外，L-RAS可能通过氧化应激损伤机制参与模拟失重大鼠动脉功能的适应性变化。除此之外，血管平滑肌离子通道机制可能亦参与模拟失重引起的血管适应性变化，并可能发挥关键调控作用。然而，L-RAS和血管平滑肌离子通道机制只能部分解释模拟失重所致的动脉内皮功能异常的发生。我们前期研究发现，模拟失重引起大鼠动脉血管产生氧化应激损伤，无论在弹力型大动脉（腹主动脉和颈总动脉）还是在肌型小动脉（脑动脉），活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要成份超氧阴离子（superoxide anion，O2-·）水平均明显升高。核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）被认为是一种重要的转录因子，参与心血管系统的炎性反应、细胞增生、分化和凋亡等过程。在心血管功能和结构的调节机制中，NF-κB是L-RAS和ROS下游的共同通路，参与多种心血管疾病血管功能损伤的病理生理过程。在失重/模拟失重状态下，NF-κB是否参与弹力型大动脉及肌型小动脉功能的损伤过程目前尚未有报道。另外，本实验室前期工作中仅在动脉血管炎性反应方面作了初步研究，对模拟失重后动脉炎性反应情况尚缺乏全面的了解。NF-κB是否通过炎性反应机制参与模拟失重大鼠前身和后身弹力型大动脉及肌型小动脉血管内皮功能的重塑过程也有待进一步探讨。 为了回答上述问题，我们采用尾部悬吊大鼠模型模拟微重力对心血管系统的影响，并进行以下工作： 1.模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉血管NF-κB蛋白表达与活性改变 采用Western blot方法观察模拟失重3天、14天和28天后大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉NF-κB亚单位p65蛋白在胞核与胞浆的分布变化以及IκBα蛋白的表达变化，检测模拟失重对NF-κB由胞浆向胞核转位的影响并确定何时影响最为明显。另外，使用NF-κB抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC,100 mg/kg/day）慢性灌胃干预处理，观察模拟失重后NF-κB DNA结合能力的变化，并观察PDTC对模拟失重大鼠动脉NF-κB DNA结合能力的抑制作用。 2.模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉血管炎性反应及NF-κB的调控作用 通过en face免疫荧光染色和离体血管内皮单核细胞粘附能力检测，观察模拟失重大鼠腹主动脉和颈总动脉的单核细胞浸润情况以及动脉内皮的单核细胞粘附能力；通过Western blot和免疫组织化学染色方法检测模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉炎性反应相关因子血管细胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule1，VCAM-1）、E-选择素（E-selectin）和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP-1）的表达变化；通过酶联免疫吸附法检测模拟失重大鼠血浆中白介素6（interleukin6，IL-6）含量的变化。另外，采用PDTC慢性干预处理，通过实时定量 PCR方法检测 NF-κB激活对模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉VCAM-1、E-selectin和MCP-1 mRNA水平的影响。 3. NF-κB通路抑制剂PDTC对模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和大脑中动脉舒张反应性的影响 采用PDTC慢性干预处理，通过动脉反应性测定，观察PDTC对模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和大脑中动脉血管舒张反应性变化的影响。 本工作的主要结果如下： 1.模拟失重增强了大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉血管NF-κB的活性 Western blot结果表明：与对照组相比，模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉NF-κB亚单位p65蛋白在胞核中表达随悬吊时间的延长而逐渐增加，胞浆p65和IκBα蛋白的表达则随着悬吊时间的延长而逐渐降低，其中腹主动脉变化早于颈总动脉和脑动脉。凝胶电泳迁移率分析结果显示：28天模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉NF-κB的DNA结合能力与对照组相比均明显增强；PDTC慢性干预处理明显降低了腹主动脉、颈总动脉和脑动脉增强的NF-κB DNA结合能力，但在脑动脉仅有部分恢复。 2.模拟失重增强了大鼠腹主动脉和颈总动脉的单核细胞浸润及与THP-1细胞的粘附，NF-κB参与模拟失重引起的大鼠腹主动脉、颈总动脉及脑动脉血管炎性反应的发生 En face免疫荧光染色结果显示，模拟失重大鼠腹主动脉和颈总动脉单核细胞浸润增加。离体血管内皮单核细胞粘附能力测定结果显示，模拟失重大鼠腹主动脉和颈总动脉内皮表面粘附的THP-1细胞明显增多。Western blot和免疫组织化学实验结果显示：模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉血管E-selectin和MCP-1蛋白表达上调；VCAM-1在模拟失重大鼠颈总动脉和脑动脉表达上调，但在腹主动脉表达没有改变；模拟失重大鼠各动脉增加的炎性因子阳性表达主要集中于内皮层和平滑肌内层。酶联免疫吸附结果显示，模拟失重大鼠血浆中IL-6水平与对照组大鼠相比明显升高。实时定量PCR结果显示：模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉VCAM-1、E-selectin和MCP-1的mRNA水平与对照组相比均明显增高；PDTC慢性干预处理明显降低模拟失重大鼠腹主动脉和颈总动脉炎性因子的mRNA水平，在脑动脉仅降低了MCP-1的水平。 3. NF-κB介导的炎性反应参与模拟失重所致大鼠腹主动脉、颈总动脉和大脑中动脉内皮依赖性舒张功能的降低 离体动脉血管环实验表明：模拟失重大鼠腹主动脉、颈总动脉和大脑中动脉ACh介导的内皮依赖性舒张反应性与对照组大鼠相比明显降低；PDTC慢性干预处理可明显改善模拟失重大鼠腹主动脉和颈总动脉降低的内皮依赖性舒张反应性，但在大脑中动脉仅有恢复趋势。 总之，本工作发现模拟失重可导致大鼠腹主动脉、颈总动脉和脑动脉血管NF-κB激活并诱发炎性反应，首次提出NF-κB介导的炎性反应可能在模拟失重所致动脉功能重塑过程中发挥重要作用。本工作有助于阐明失重/模拟失重所致心血管失调的发生机制，亦可为发展新的有效对抗措施提供理论依据。
血管重塑;内皮依赖性舒张;炎性反应;蛋白表达;动物模型
第四军医大学
博士
基础医学
马进
2014
中文
R654.3
112
2016-03-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）