大菱鲆养殖环境细菌多样性分析及水产病原菌基因芯片检测体系的构建
为完善水产病害预警监测机制，本文在使用宏基因组测序技术、分离培养及分子靶标鉴定等手段对海水养殖系统中的致病菌或潜在病原菌存在情况、大菱鲆幼鱼肠道及其养殖环境菌群结构进行研究的同时，针对水产养殖高度集约化趋势及水产病害频发的现状，结合历史文献资料，尝试构建检测灵敏度高、检测通量大且较为经济的病原菌基因芯片技术，为实现工厂化养殖过程中的疾病监测和预警提供技术支持。 本论文对2013~2014年间发生在山东胶南的大菱鲆幼鱼腹水症病原菌进行分离鉴定。结果从三批患腹水病的幼鱼体内分离多种优势菌株，经人工感染实验，发现有一株菌株能够使大菱鲆幼鱼产生腹水、死亡现象，经过16S rRNA基因、gyrB基因测序比对，将该株菌鉴定为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，其半致死浓度为3.6×108 CFU·mL-1，此为首次报道该菌能够感染大菱鲆幼鱼。 以溶血为表征对山东近岸养殖环境中的潜在条件致病菌进行的筛查结果为：从养殖环境中分离鉴定出19株溶血弧菌，以属于灿烂支系（11/19）、哈维支系（6/19）的弧菌居多，且存在多种已报道的水产病原菌，如哈维氏弧菌、溶藻弧菌、欧文氏弧菌等。通过人工感染实验发现两株欧文氏弧菌、一株哈维氏弧菌表现出一定的毒力，并经过毒力基因检测发现该三株菌均含有哈维氏弧菌溶血素编码基因vhhB的同源基因，说明在近岸养殖环境中存在潜在的条件致病菌。此外通过对分离弧菌的分子鉴定靶标比较，发现铁摄取调节蛋白编码基因fur显示出较好的分类靶标作用，可以作为弧菌属分子鉴定的靶标基因。 通过对大菱鲆幼鱼肠道及其养殖环境菌群结构进行分析发现，相比于大菱鲆幼鱼肠道，养殖水体中细菌多样性更高，其中假交替单胞菌属Pseudoalteromonas、交替单胞菌目某属unclassified Alteromonadales、假单胞菌属Pseudomonas、弧菌属Vibrio、别弧菌属Aliivibrio的比例较为一致；而在大菱鲆样本中弧菌属占优势地位，其次为假单胞菌属。 在结合上述研究结果和结合文献资料分析的基础上，本论文构建了能够检测9种水产病原菌的31种基因的基因芯片，经检测其探针特异性为100％，对亲缘关系较近的菌株间没有出现交叉反应，通过对患病大菱鲆样本检测对比，发现基因芯片检测的灵敏度较好，能够分辨出 PCR技术检测不出的基因。此外基于多重 PCR技术，还对基因芯片检测体系进行优化。确定当杂交温度为60℃、杂交时长为2 h、探针浓度为4μmol·L-1、Cy3标记的随机引物的用量为150 pmol时，芯片的经济性、灵敏度、检测效率达到均衡。优化后的芯片对溶藻弧菌全基因组DNA检测灵敏度为10 fg，高出PCR方法约2个数量级，且可以在12 h内完成检测。
大菱鲆;幼鱼腹水症;细菌多样性;毒力基因;基因芯片;检测体系
国家海洋局第一海洋研究所
硕士
海洋生物学
王宗灵;曲凌云
2015
中文
S941.4
103
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）