南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L光修复酶基因及其修复DNA损伤分子机制研究
光复活修复是生物体的一种重要的DNA损伤修复机制，对保持生物体遗传信息的延续性、遗传结构的完整性有重要作用。所谓光复活修复，是指在 DNA光修复酶（photolyase）的作用下以光为驱动力来修复紫外线损伤的DNA，可见，光修复酶是光复活修复作用最主要的功能物质。 南极冰藻是指生活在南极海冰、海冰边缘或海水等极端环境中的一大类微藻的总称，是南极地区主要的初级生产者。南极冰藻长期在南极强紫外辐射环境中生长和繁殖，光修复酶承担了修复其 DNA损伤的重要功能。南极冰藻 DNA光修复酶对其紫外辐射损伤 DNA的修复作用是南极衣藻抵抗紫外增强和适应南极强紫外线辐射生境的关键生存机制，因此，从分子水平上研究南极冰藻的光复活修复作用是非常有必要的。南极衣藻 Chlamydomonas sp. ICE-L是一种真核单胞藻，是南极冰藻类群中数量最多和最具有代表性的一种绿藻，对它的光修复酶的研究可以为南极生境和其他物种的研究提供基础。 本论文主要进行了以下研究内容：普通 PCR和RACE法克隆获得了南极衣藻 Chlamydomonas sp. ICE-L的光修复酶基因 PHR2并对PHR2基因进行了生物信息学分析；应用实时定量 PCR技术对南极冰藻 Chlamydomonas sp. ICE-L光修复酶基因 PHR2的转录调控机制进行了研究；为验证 PHR2光修复酶的功能，构建了光修复酶基因PHR2的原核表达载体并实现了在原核表达系统BL21（DE3）中的表达；通过单因素实验、Box-Behnkens设计和响应面分析法对PHR2蛋白的表达条件进行了优化，建立了影响因素的二次回归模型；利用Ni-NTA亲和层析对目的蛋白进行纯化，获得纯度较高的目的蛋白；利用Edman降解法对目的蛋白进行 N端测序；验证了PHR2光修复酶在表达菌株中的修复活性和光修复酶的体外修复活性。 克隆得到南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L光修复酶基因PHR2 cDNA全长为2651 bp，编码579个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为64.3 KDa，同源性对比发现 PHR2的氨基酸序说列与莱茵衣藻的PHR2的相似度为68％；qRT-PCR结果显示，在强光和紫外胁迫条件下 PHR2表达量升高，说明 PHR2基因对强光和紫外胁迫时敏感的；SDS-PAGE电泳分析表达的目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于细胞破碎液上清中，且分子量与预测分子量相同；响应面分析法得到PHR2蛋白最佳表达条件为pH6.98、NaCl浓度为1.4%、IPTG作用浓度为0.53 mmol/L、诱导温度为22℃，经验证，优化条件下目的蛋白的表达量与理论预测值基本吻合；Ni-NTA层析纯化后目的蛋白相对含量升高，杂蛋白含量减少；N端测序确认目的蛋白N端到C端序列依次为D/Q/T/A-P-K-R-T，与目标序列基本相符，确认为 PHR2光修复酶；活性分析试验证明 PHR2光修复酶体内外活性良好，可以有效的修复紫外辐射损伤。
南极冰藻;光修复酶;PHR2基因;原核表达;DNA损伤修复;分子机制
国家海洋局第一海洋研究所
硕士
海洋生物学
缪锦来
2015
中文
Q178.53
100
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）