RNF111通过调控TGF-β/Smad信号通路影响非小细胞肺癌转移的表观机制
背景与目的： 由于发病率和死亡率增长最快，肺癌成为对人群身体健康威胁最大的恶性肿瘤之一。而且因为早期诊断技术和后期的有效治疗的缺乏，约占肺癌85％的非小细胞肺癌有着高达86%的死亡率，因此，探索和研究清楚非小细胞肺癌的致病机理则显得尤为重要。DNA的甲基化作为表观遗传学研究的重要内容之一，被认为是最典型导致基因表达或者沉默的机制，大量的研究也表明它与肿瘤的发生发展密切相关。TGF-β信号通路的异常与多种肿瘤的发生和转移有着紧密的联系。RNF111基因编码的蛋白Arkadia可以通过泛素化途径促进TGF-β信号通路中的负调控因子Smad7,SnoN和 Ski的降解来增强TGF-β信号通路。本研究主要通过检测RNF111基因在两株非小细胞肺癌95C（低转移）和95D（高转移）中mRNA表达水平，来探索两株细胞株中RNF111的mRNA表达水平的差异与基因启动子区甲基化引起的基因转录调控改变之间潜在的机制。 方法： Transwell实验检测95C、95D和A549细胞的迁移和侵袭能力；运用Real-Time PCR和western blot检测2株细胞株（95C和95D）中RNF111基因的表达,并且取6对模拟95C和95D细胞的NSCLC患者癌组织样本，检测组织中RNF111的mRNA水平；同时利用BSP克隆测序的方法分析95C、95D细胞株和组织中的CpG位点的甲基化频率，分析这些CpG位点甲基化频率的差异是否与其基因表达水平的差异相关；用Western Blot检测TRANSFAC软件预测的转录因子SP1在95C和95D细胞中的表达情况；利用EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验技术，验证RNF111启动子的-459CpG位点的甲基化是否影响转录因子对启动子的的结合。用ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）方法分析SP1能否与-459CpG位点结合；构建荧光素酶报告基因质粒和双荧光实验来检测SP1的结合与否对RNF111启动子活性的影响，并且验证-459CpG位点甲基化是否能够降低RNF111的启动子活性，同时运用western blot方法检测RNAi干扰SP1之后RNF111的表达；RNAi方法干扰RNF111后运用western blot方法检测TGF-β通路标记分子p-SMAD3和E-cadherin等在95C和95D中表达。 结果： 用去甲基化药物5-Aza处理95C和95D细胞后，RNF111基因表达水平明显升高，暗示着DNA的甲基化影响了RNF111基因的表达；通过TRANSFAC软件预测和CHIP实验的验证，RNF111基因启动子区的-459CpG位点是一个功能性位点，转录激活子SP1能够与-459CpG位点结合;SP1结合位点缺失和突变的荧光素酶检测实验说明SP1能够增强RNF111启动子活性；而且通过EMSA和荧光素酶检测实验证明了-459CpG位点的甲基化能够降低转录因子与RNF111基因启动子区的结合能力及RNF111的启动子活性；在转移的NSCLC细胞中，干扰RNF111的相关实验暗示RNF111增强了TGF-β/Smad信号通路的活性和非小细胞肺癌细胞株的转移和侵袭能力。 结论： 研究显示在非小细胞肺癌细胞株中，RNF111基因近端启动子区-459CpG位点的甲基化降低了RNF111基因的表达，可能的机制是-459CpG的甲基化抑制了转录激活子SP1与RNF111近端启动子区的结合能力，从而抑制了RNF111基因的表达，同时由于RNF111表达受抑制，也减弱了TGF-β/Smad信号通路，降低了p-SMAD3和Snail表达水平，上调了E-cadherin的表达。
非小细胞肺癌;RNF111启动子区;-459CpG位点;信号通路;甲基化水平
苏州大学
硕士
遗传学
张洪涛
2015
中文
R734.2
65
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）