斑马鱼生物钟基因clock1a的功能研究
在自然界中所有生物都存在一种近似24小时的昼夜节律，称为生物钟。生物钟在细胞、组织等水平上都具有调节作用。生物钟紊乱会给身体带来极大的危害，例如睡眠失调、代谢失调、衰老提前。 生物钟的分子机制主要依赖一个细胞自主调控的转录翻译反馈环路。该环路由一对正向调节因子和一对负向调节因子组成：CLOCK和BMAL形成异二聚体，结合到per和cry启动子区域的E/E’-box来激活它们的转录。随后，PER和CRY蛋白在细胞质结合形成复合体并进入细胞核内，通过作用于CLOCK: BMAL异二聚体，从而反馈抑制其本身转录。 斑马鱼中存在clock基因的3个拷贝，它们在不同组织器官中转录振荡。斑马鱼已经演化出不同的clock基因表达机制，并且这三个基因的功能已经出现了分化。但这三个clock基因的具体功能至今还不清楚。 本研究利用CRISPR-Cas9技术成功获得了缺失7个碱基的斑马鱼clock1a突变体。荧光素酶报告实验表明突变的clock1a不能激活e4bp4-2b转录活性。实时定量PCR显示，在纯合 clock1a突变的斑马鱼幼体中，其反馈环路下游的生物钟基因per1a、per1b、per2、per3、cry1aa、cry1ab、cry1ba、cry1bb表达在正常光暗和持续黑暗条件下都显著改变。clock1a突变体斑马鱼幼鱼在正常光暗条件下的运动振幅增加。而在连续黑暗的情况下，clock1a突变体斑马鱼则完全失去了节律。clock1a敲除斑马鱼幼鱼的高活动量在成鱼中也得到了证实。实验显示在大部分时间点clock1a敲除斑马鱼成鱼的活动量显著高于同龄的野生型成鱼。这些结果表明Clock1a在保持斑马鱼生物钟的正常运转中起到不可或缺的作用。 在镜面攻击试验中，clock1a敲除斑马鱼成鱼对于其自身影像更具有攻击性。这些结果表明在斑马鱼中，clock1a敲除斑马鱼成鱼也表现出躁狂症相似的表型。Li+是一种精神稳定药物，常常用来治疗躁狂症。我们使用Li+来处理clock1a敲除斑马鱼幼鱼，来验证其是否能拯救该鱼的异常。实验表明Li+能够有效的使鱼的行为恢复到正常的水平。这也揭示了clock1a在保持生物钟系统的正常运转及正常行为规律上的重要作用。 另外，clock1a敲除导致雌鱼所产胚胎量大幅上升，其生殖相关基因lh、lhr、fsh、fshr及卵黄蛋白原基因vtg的表达上调，但体内促黄体素、促卵泡素、雌激素含量并没有受到影响。clock1a敲除对雄鱼生殖没有影响。 为了深入研究clock1a的调节功能，我们通过高通量转录组测序检测clock1a-/-突变体胚胎在ZT2（11:00,98hpf）和ZT14（23:00,110hpf）时的基因表达谱。与野生型相比，在ZT2时clock1a-/-突变体有244个基因上调，406个基因下调；而在ZT14时clock1a-/-突变体有184个基因上调，249个基因下调。并且clock1a-/-突变体在不同时间点的差异表达基因也不同，在clock1a-/-突变体中ZT2和ZT14时期有159个相同的差异表达基因。其中凋亡蛋白酶相互作用蛋白Apip的表达水平下降了近7倍，分析该基因发现在其启动子上存在经典的E box元件。apip可能是clock1a的靶基因，这说明 clock1a参与细胞凋亡的调节。另外，肌动蛋白结合蛋白anillin的表达也下调，说明clock1a也调节细胞的胞质分裂。 本论文构建了clock1a敲除斑马鱼，初步探索了clock1a敲除对其他核心生物钟基因表达以及行为的影响，也揭示了生物钟在行为、生理、生殖方面的作用。为完善现有的生物钟环路做出贡献，也为后续的研究提供了基础。
斑马鱼;生物钟基因;分子机制;细胞调控;转录功能
苏州大学
硕士
遗传学
王晗
2015
中文
Q756
73
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）