Timeless通过结合Cry1aa负向调控斑马鱼生物钟
地球自转导致了昼夜交替变化。从低等单细胞生物到高等动物人类，对这种昼夜循环的长期适应而演化出的计时机制即生物钟。生物钟调节大约24小时的周期性生理和行为，包括饮食、睡眠和体温等。经典的生物钟反馈环路为Clock和Bmal蛋白形成异二聚体，随后激活下游per和cry基因的表达，Per和Cry蛋白也形成异二聚体从而抑制Clock:Bmal蛋白复合物的活性。 目前对于核心生物钟基因调控机制的研究主要集中在核心生物钟基因的解析和功能研究，对于不同物种之间基因功能的演化还知之甚少。在果蝇中，timeless是核心生物钟基因，对per进行转录后调节，在细胞核内定位和蛋白质稳定性等方面起作用。在小鼠中，Timeless的生物钟功能仍处于争论中，但其在生长发育中所起的作用已被证实，靶向性敲除Timeless的小鼠会致死。而在斑马鱼的经典反馈环路中，timeless的定位和功能仍不清楚。 无脊椎动物中存在的两个timeless基因，而脊椎动物中只有一个。我们通过系统树分析发现，斑马鱼的timeless与果蝇的timeout（tim2）序列更为相似。实时定量PCR方法发现，在幼鱼中，timeless基因的表达呈现明显的节律性；而在bmal1b和clock1a突变体中，timeless基因的表达呈现下调。我们发现timeless的启动子含有多个E’-box和E-like-box，通过ChIP实验发现Bmal1b蛋白可以结合到ATG上游-6508位置的E’-box上，并且通过体外细胞实展示包含有该E’-box的timeless的启动子可以被Clock1a:Bmal1a蛋白复合物激活，同时被生物钟负向因子Cry1ba所抑制。这些结果表明生物钟直接调控timeless的表达。 我们采用TALEN（Transcription activator-like effector Nuclease）技术建立斑马鱼timeless突变体，进一步研究该基因的功能。实时定量分析发现在timeless纯合突变体幼体中核心生物钟基因（bmal1b、clock1a、cry1aa、per1b和per3）和生物钟调控基因（aanat2）均呈现上调或部分上调，说明timeless为这些基因的正常表达所必须；行为实验展示在持续黑暗条件下，timeless突变体的运动周期与野生对照延长半小时。而在突变体成鱼的各个组织中，timeless基因自身的mRNA水平明显下调并失去节律，而生物钟基因（bmal1b、clock1a、cry1aa、per2）基因的表达受到不同程度的影响，说明在不同组织中，timeless基因的功能具有组织特异性。这些结果表明timeless在斑马鱼生物钟调控环路中起到不可或缺的作用。体外细胞定位实验发现，Timeless在核内和细胞质中均有表达。免疫共沉淀实验表明Timeless通过N-端的LXXLL结构域结合Cry1aa，而不结合Per1b、Per2或Cry1ba。体外细胞转染实验表明Timeless可以通过结合Cry1aa而增强Cry1aa对生物钟环路的抑制作用，而单独Timeless无抑制功能。因此，timeless是斑马鱼生物钟重要的调控元件。高通量深度测序分析在持续光暗条件下timeless突变体幼体在CT2（11:00,98 hpf）和CT14（23:00,110 hpf）时与相应野生型对比的差异表达基因发现，突变体中细胞周期和生长发育有关基因spice1,smac1和tshz1下调，而早期生长应答因子egr2a基因上调。说明timeless基因除了在生物钟系统中发挥重要作用之外，可能在斑马鱼的生长发育和细胞周期调节上也有一定的作用。 本研究阐明了斑马鱼timeless基因既直接受生物钟调控，又为斑马鱼生物钟调节所需；Timeless通过结合Cry1aa负向调节斑马鱼生物钟；Timeless可能在斑马鱼的生长发育和细胞周期上发挥调节作用。这些发现对于斑马鱼生物钟的分子机制研究以及生物钟调节其他生命过程的研究有重要意义；为进一步完善现有的生物钟环路以及后续的研究生物钟调控生命过程提供了基础。
斑马鱼;生物钟;timeless基因;Cry1aa基因;负向调节
苏州大学
硕士
遗传学
王晗
2015
中文
Q756
83
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）