非小细胞肺癌中LHX2基因异常表达的microRNA调控机制
背景与目的： 肺癌是世界范围内最常见的癌症，其中非小细胞肺癌（NSCLC）几乎占85％以上。LHX2属于LIM蛋白家族，现已有研究发现，LHX2能够促进肿瘤的发生发展，但具有的作用机制还不是很清楚。microRNA对基因表达的调节作用是通过与特定靶基因3’UTR种子序列的完全或不完全互补配来实现的。研究表明在癌症的发生和发展中检测到了microRNAs表达的改变。预测显示多个microRNAs可以靶向LHX2的3’UTR区域。本研究旨在探讨NSCLC中LHX2表达的microRNA调控机制，为NSCLC的早期诊断和治疗提供确凿的实验依据。 方法： （1）Real-Time PCR和Western Blot方法分别检测在人正常支气管细胞HBE和4株NSCLC细胞中LHX2基因的mRNA和蛋白的表达水平以及50对NSCLC组织样本中LHX2基因的mRNA表达水平。 （2）将si-LHX2-1和si-LHX2-2转染至NSCLC细胞株A549和LTEP-α-2中，通过CCK-8和细胞集落形成方法观察细胞的增殖情况，验证LHX2对细胞增殖的作用。 （3）生物信息学软件预测分析能够靶向LHX23’UTR区域的microRNAs，我们筛选到miR-1238。首先运用双荧光素酶活性检测实验验证miR-1238是否与LHX23’UTR区域的种子序列直接结合，验证miR-1238对LHX2的靶向作用。然后合成miR-1238 mimics瞬时转染A549和LTEP-α-2细胞，检测转染前后LHX2 mRNA和蛋白表达变化， （4）Real-Time PCR方法分别检测在人正常支气管细胞HBE和4株NSCLC细胞以及50对NSCLC组织样本中miR-1238表达水平，并将其和LHX2的表达作回归分析，统计出NSCLC中LHX2和miR-1238表达的相关性。 （5）将miR-1238的模拟体mimics转染至NSCLC细胞株A549和LTEP-α-2中，通过CCK-8和细胞集落形成方法观察细胞的增殖情况。 结果： （1）a、与HBE相比，LHX2 mRNA和蛋白在NSCLC细胞株A549、LTEP-a-2、H460和H1299中的表达均是上升的。b、在50例NSCLC组织样本中LHX2 mRNA表达上调（p<0.05）。综上所述，LHX2基因在NSCLC中的表达是上升的。 （2）通过CCK-8和集落形成实验可知，干扰LHX2基因后，NSCLC细胞株的增殖是受到抑制的，因此，LHX2基因能够促进NSCLC细胞株生长。 （3）Dual Luciferase Reporter Assay实验可知miR-1238可以结合在LHX2基因的3’UTR区。NSCLC细胞株A549和LTEP-α-2瞬时转染miR-1238模拟体mimics，LHX2基因的mRNA和蛋白表达都下降。因此miR-1238下调LHX2基因的mRNA和蛋白表达并且这种作用是通过miR-1238与LHX2基因的3’UTR种子序列直接结合引起的。 （4）与HBE相比，在NSCLC细胞株A549、LTEP-a-2、H1299和H460中miR-1238的表达是下调的。在49例NSCLC组织样本中miR-1238的表达也是下降的。也就是说，在NSCLC中miR-1238是低表达的。将其和LHX2的表达作回归分析发现NSCLC中两者的表达之间是负相关的。 （5）通过CCK-8和集落形成实验可知，miR-1238抑制NSCLC细胞株的增殖。 结论： NSCLC细胞中，miR-1238低表达，LHX2高表达，并且 miR-1238能够直接靶向LHX2的3’UTR种子序列。在50对肺癌组织中，同样是miR-1238低表达和LHX2基因高表达，并且呈现负相关。对miR-1238和LHX2基因功能分析可知，miR-1238能够抑制肿瘤的生长，LHX2促进肿瘤的生长，过表达miR-1238能够下调LHX2 mRNA和蛋白的表达量。因此，miR-1238可能是一种抑癌基因，在肺癌的发生发展中，通过抑制LHX2基因的表达来抑制肿瘤的生长。通过研究miR-1238对LHX2基因的抑制作用可能会有助于提高我们对NSCLC的致病机制的了解，进而对NSCLC的诊断和治疗提供可靠的理论基础。
非小细胞肺癌;LHX2基因;异常表达;microRNA调控;早期诊断
苏州大学
硕士
遗传学
张洪涛
2015
中文
R734.2
71
2015-12-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）