树木溃疡病菌多重PCR-基因芯片检测技术构建及在生态中的应用
杨树溃疡病病原种类多样，寄主广泛。无性型多样，种间形态特征有重叠；有性型不常发现，且病原的检测常受到地理、寄主、分类知识的限制，由此需要发展非依赖分离培养方法的病原鉴定和林间诊断技术。通过对多种核酸模板和具遗传标记功能的多个靶标核酸序列（基因）的扩增、测序和比对，多重PCR扩增技术及基因芯片检测技术可以直接用于环境样本的分析。多重PCR同时平行通量扩增多个模板或位点，芯片具有同时平行通量检测多种病原菌的潜力，二者的联合可完成快速高通量并行的检测多个物种，目前对多种溃疡病病原的研究中还没有应用多重PCR-基因芯片（ArrayTube）技术。 本研究目的虽是建立树木溃疡病快速高通量鉴定的多重PCR-基因芯片技术平台，但该技术同时能够适应于以生物种群分析和鉴定为基础的其他林业微生物研究与开发应用中，能有效地解决和准确的鉴定鉴别及分析林业微生物中遇到的快速判定难题，研究结果也为树木病害相关的病原生态学，病害流行学的研究奠定了基础。 本研究通过病原菌种类及其发生溃疡病的严重性，核酸标记信息丰富性等分析，选择以葡萄座球腔菌为主要检测对象，包括Val sa、Leucostoma和Entoleuca属的16个种，并通过BioEdit软件，建立了相关溃疡病病原真菌的靶标核酸序列数据库，分析了种属间靶标序列内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）和延伸因子（Elongation Factor-1α，EF-1α）差异性，共设计出26对探针（ITS：12条；EF-1α：14条），完成定制 ArrayTube芯片。在芯片有效性评估中，首先，搜集12种供试菌株，包括子囊菌Botryosphaeria dothidea，Botryosphaeria berengeriana；Valsa sordida，Ascochytasp.，Botryosphaeria rhodina，Leucostomasp.，Valsa ambiens，Entoleuca mammata，Leptographium terebrantis；卵菌Phytophthora cactorum；担子菌Agaricus bisporus；接合菌Cunninghamella bertholletiae。将菌株进行活化培养，提取DNA，选择不同引物（生物素标记）进行单一ITS和EF-1α的PCR和多重PCR扩增；其次，设置不同靶标种属及靶标序列不同浓度对芯片的专化性和灵敏度进行验证；最后，将有效化评估后的多重PCR-ArrayTube芯片技术应用于环境样本中，即以北京12个区县调查点的杨树为对象（24个样本包括12个感病，12个健康），直接提取环境样本总DNA多重PCR扩增之后进行芯片杂交，并以克隆为辅助手段进行芯片检测结果的偏差性验证。研究还就有关病原菌种群多样性伴随的内生菌区系进行了初步的分析。 结果表明：对于溃疡病病原菌的研究，经过优化，选择真菌通用引物 ITS1/ITS4和EF1-728F/EF1-986R，退火温度为55.6℃，各引物终浓度为0.2μM，建立的多重 PCR扩增ITS和EF-1α体系，可以成功地扩增出室内供试菌株和环境样本真菌的目的条带。并通过测序比对鉴定出多种来自培养和环境病害组织中的溃疡病病菌，多重PCR能够检测到1ng的基因组 DNA。芯片有效性评价上，除 E.mammata外杂交11个种，靶标菌株B.dothidea，V.sordida，B.rhodina(L.peudotheobromae)能够杂交上所建立的芯片上特异性（专化性）探针，其余未杂交上靶标探针；除Ascochyta sp.，其余对照菌株L.terebrantis，P.cactorum，A.bisporus，C.bertholletiae杂交结果呈阴性；通过不同浓度（1ng，0.1ng，0.01ng）的多重PCR产物模板研究，表明芯片灵敏度可检出0.1ng的靶标核酸含量。通过对来自北京不同区县的24个样本芯片检测测试表明，芯片能有效直接检测出感病和健康样本中的B.dothidea、V.sordida，与样本的克隆测序得到的结果基本吻合。结合芯片检测环境样本，对采集到的杨树组织环境样本进行了分离纯化、形态鉴定和序列分析后，得到了子囊菌和担子菌；其中 Botryosphaeria spp.，Valsa spp.为优势菌，此外还有菌群Coniothyrium spp.、Fusarium spp.、Peyronellaea spp.、Hyalodendriella spp.、Alternaria spp.、Lecanicillium lecanii、Leucostoma niveum、Meyerozyma guilliermondii、Colletotrichum gloeosporioides、Schizophyllum commune、Funalia trogii，其中有些菌作为内生菌存在，这为多重PCR-基因芯片的开发以及在病原菌与内生菌关系，病原菌与寄主互作关系以及森林病原菌微生物生态学方面的应用奠定了基础。
树木溃疡病;基因芯片;病原真菌;环境样本;微生物生态学
中国林业科学研究院
硕士
森林保护学
严东辉
2012
中文
S763.15
98
2015-08-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）