人源S100A4蛋白的功能表达及单抗制备
目的: 本研究采用全基因合成法，PCR（polymerase chain reaction)合成S100A4基因片段。构建表达人源S100A4蛋白的重组质粒，并使之高效表达，再以纯化后获得的人源S100A4蛋白免疫Balb/c小鼠，从而制备稳定分泌抗人S100A4单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞系，并对其分泌的mAb进行性质鉴定。 方法: 1.采用全基因合成法，PCR合成S100A4基因片段。并根据大肠杆菌密码子偏好性，利用Condonopt密码子优化软件优化从GeneBank中检索到的人源S100A4基因序列，全部选用偏好密码子设计合成S100A4序列引物。通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a-S100A4重组载体。 2.将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thingalactopyranoside，IPTG)诱导后表达的重组蛋白再经离子交换层析纯化。 3.用免疫印迹(Western-blot)法检测重组蛋白的抗原活性，肿瘤细胞侵袭及迁移实验验证重组蛋白生物活性。 4.用纯化后获得的人源S100A4重组蛋白免疫Balb/c小鼠，利用杂交瘤细胞融合技术制备抗人S100A4的mAb。 5.对mAb进行性质鉴定，包括用Western-blot及交叉试验鉴定mAb的特异性，用间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测mAb腹水效价及mAb的亲和力等。 结果: 1.合成了人源S100A4基因全长，并成功构建人源S100A4蛋白表达载体pET32a-S100A4，经酶切鉴定及测序证明基因序列完全一致。 2.成功进行了人源S100A4蛋白的诱导表达、纯化及鉴定，其纯度达到95％以上。Western-blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明重组蛋白具有免疫学特异性。肿瘤细胞侵袭及迁移实验显示人源S100A4蛋白具有生物活性。 3.经免疫小鼠、细胞融合后获得6株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞系，Western-blot分析显示，该mAb能与具有生物学活性的人源S100A4蛋白结合。成功制备鼠抗人S100A4蛋白单克隆抗体，腹水mAb效价可达204800。6株单抗的亲和常数均达到108以上，表明抗原与抗体结合的紧密程度较高。交叉实验结果显示6株单抗均具有较高的特异性，符合制备单克隆抗体的要求。 结论: 1.成功构建了人源S100A4基因重组克隆质粒，经酶切鉴定、PCR特异性鉴定和序列比对分析证实为目的基因。 2.原核表达系统可高效表达重组人源S100A4蛋白。经离子交换层析纯化后可获得高纯度目的蛋白。肿瘤细胞侵袭及迁移实验显示人源S100A4蛋白具有生物活性。 3.成功建立了能稳定分泌单抗的6株杂交瘤细胞系，制备出鼠抗人 S100A4蛋白的单克隆抗体，并对其性质进行了鉴定，为进一步用于人源S100A4的临床检测和实验研究创造了条件。
S100A4蛋白;重组质粒;原核表达载体;全基因合成法;单克隆抗体;动物模型
天津体育学院
硕士
运动人体科学
刘洪涛
2011
中文
R392.11
76
2015-08-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）