过量碘致小鼠甲状腺胶质潴留机理研究及干预性功能食品研制
背景与目的: 甲状腺胶质潴留是指甲状腺滤泡中胶质（I-，T3、T4）合成过多，转运受阻的一种病态现象，是高碘性甲状腺肿常见的病理特征。甲状腺胶质潴留的发生机理与诸多原因有关，其中碘摄入水平被认为是最重要的影响因素。至今为止碘过量引起的作为甲状腺肿大病理特征的甲状腺胶质潴留的发生机制尚不清楚，随着其发病率逐年升高，近年来引起了高度重视。 甲状腺胶质潴留是一个复杂的过程，涉及多个环节，如碘摄入与转运、碘离子活化、酪氨酸残基的碘化和缩合作用、甲状腺胶质合成与储存、甲状腺胶质的释放、甲状腺球蛋白水解以及甲状腺激素转运等过程。以上过程紧密有序联系，共同调节甲状腺胶质合成、释放及转运，只要其中任何一个环节发生异常都可能导致甲状腺胶质潴留发生。并且，若机体下丘脑—垂体—甲状腺轴甲状腺激素反馈作用失调也可加重甲状腺胶质潴留。然而，究竟是哪些关键环节及关键基因发生异常导致甲状腺胶质潴留的发生，以及下丘脑—垂体—甲状腺轴在甲状腺胶质潴留的发生过程中如何发挥其调节机制，目前都尚缺乏研究。甲状腺胶质潴留是高碘性甲状腺肿常见的病理特征，全面认识甲状腺胶质潴留的发生过程及机制将有利于揭示高碘性甲状腺肿的发生机理。 因此，本课题建立7个月小鼠过量碘模型，研究甲状腺胶质合成、释放与转运涉及的多个环节及相关调控基因，结合甲状腺激素反馈机制，通过形态学方法和分子生物学方法从源头开始探讨长期过量碘致甲状腺肿大病理特征甲状腺胶质潴留的发生机制，为进一步阐明高碘性甲状腺肿大机理提供有价值的资料。 同时，本课题除了研究过量碘致小鼠甲状腺胶质潴留的机理，还进行了相关干预性功能食品的研制。已有研究表明，过量碘能降低甲状腺及血液抗氧化水平，引起氧化应激，造成甲状腺功能损伤，是甲状腺胶质潴留发生的可能机制，通过补充硒、维生素C、维生素E等抗氧化物质可改善机体抗氧化水平。因此，研制富含抗氧化因子的功能食品，从食品治疗角度预防甲状腺疾病，特别是对高碘性甲状腺肿大将起到积极的防治作用。本研究选择了抗氧化能力较高的马尾松松针提取液为原料，进行马尾松松针提取液干预效果评价及马尾松松针抗氧化酸奶加工工艺研究，为功能性酸奶的研发提供理论依据，从预防疾病的角度对过量碘造成的危害起到一定的积极防治作用。 方法: 1.实验动物饲养及分组 1)第一批：刚断乳的SPF级BALB/C雌性小鼠300只，体重15-17g，3-4周龄，健康状况良好，购自广东省医学实验动物中心。环境温度22±2℃，湿度40％-70%，照明时间12±3h。定期清洁动物房以及动物用笼具、饮水瓶。适应性喂养1周后，按体重将动物随机分成5组，每组60只，每组分别给予自来水及含不同剂量KIO3高碘水，连续喂养7个月。剂量及分组如下：A组（正常对照组）：自来水；B组（高碘1组）：1500μg/L；C组（高碘2组）：3000μg/L；D组（高碘3组）：6000μg/L；E组（高碘4组）：12000μg/L。饮水以KIO3配制成碘浓度为600mg/L的碘标准贮备溶液备用，各浓度的高碘水每周配制，小鼠自由饮水、饮食。饲料为广东省医学实验动物中心提供，饲料中的碘为365μg/kg。自来水中碘含量为8μg/L。 2)第二批：实验动物的选择，饲养环境同前。BALB/C雌性小鼠28，随机分成4组，分别为空白组，高碘组，对照组，干预组，每组8只。采用自由饮水方式，空白组给予自来水，高碘组给予3000μg/L碘水，对照组经口灌胃0.02ml/g马尾松松针提取液后自由饮用自来水，干预组经口灌胃0.2ml/g马尾松松针提取液后自由饮用3000μg/L高碘水。连续喂养3个月后，进行血清GSH-Px水平检测，评估马尾松松针提取液干预效果。 2.小鼠甲状腺胶质潴留产生的检测 7个月后测定甲状腺脏器指数，病理切片下观察甲状腺组织变化，免疫组化分析甲状腺球蛋白表达情况，利用放免试剂盒检测血液TSH、FT4、FT3水平。 3.过量碘致小鼠甲状腺胶质潴留作用机制的研究 1)尿碘测定：7个月后收集小鼠晨尿，利用尿碘试剂盒测定小鼠尿碘水平。 2)甲状腺摄碘率测定：在当天上午，给全部小鼠灌胃0.5 Mci I125，分别在灌胃后20min、2h时间点处死，摘取小鼠甲状腺组织，称重，用γ计算器分别测量20min、2h小鼠甲状腺的放射性计数，本底计数，标准源计数，计算小鼠甲状腺I125摄碘率。 3)甲状腺基因测定：摘取小鼠甲状腺组织及肝脏组织，用液氮迅速冷冻，-80℃保存备用。qPCR法检测甲状腺组织中Tshr、Slc5a5（NIS)、Slc26a4（pendrin)、 Tpo、Duox2、Iyd、Ctsb、Ctsd、Slc16a2（Mct8)的mRNA表达。 4)血清GPH-Px测定：7个月后收集小鼠血清，利用 GPH-Px试剂盒测定小鼠血清GPH-Px水平。 4.马尾松松针提取液干预效果评估及其干预性功能食品加工工艺研究 通过检测3个月小鼠血清GSH-Px水平，评价马尾松松针提取液对过量碘危害的干预效果；通过单因素实验，正交实验法，感官评定，确定干预性功能食品马尾松松针抗氧化酸奶的最佳工艺和配方。 结果: 1.过量碘致小鼠甲状腺胶质潴留的产生 1)过量碘对小鼠甲状腺脏器/体重指数的影响 从碘浓度为3000μg/L的C组开始，过量碘可致甲状腺脏器/体重指数明显升高，与正常组对比有显著性差异（P<0.05），经Spearman相关检验，小鼠甲状腺脏器/体重指数与碘浓度呈显著正相关（r=0.655，P=0.01）。 2)甲状腺组织形态学观察 光境下，可见正常对照组A组的甲状腺滤泡中等大小，呈圆形或椭圆形，滤泡上皮细胞多为单层立方状或高柱状。各高碘组的甲状腺滤泡明显增大，滤泡腔内充满红色胶质，上皮细胞呈扁平状。高剂量组滤泡有融合现象。随着碘浓度的升高，甲状腺胶质潴留现象越来越明显。 3)免疫组化检测甲状腺组织中Tg蛋白的表达情况 免疫组化分析显示正常对照组A组Tg有基础表达，D、E组Tg在甲状腺滤泡腔中表达的范围和强度较对照组明显增强。 4)过量碘对小鼠血清甲状腺激素水平的影响 从碘浓度为3000μg/L的C组开始，血清TSH水平升高与对照组相比有显著性差异（P<0.05）；与正常组对比，所有实验组血清FT4水平升高与FT3水平降低有显著性差异（P<0.05）；经Spearman相关检验，碘浓度与小鼠血清TSH呈显著正相关（r=0.439，P=0.001），与血清FT4呈显著正相关（r=0.649，P=0.000），与血清FT3呈显著负相关（r=-0.320，P=0.03）。 2.过量碘致小鼠甲状腺胶质潴留作用机制的研究 1)过量碘对小鼠尿碘水平的影响 从碘浓度为1500μg/L的B组开始，小鼠尿碘水平与正常组相比明显升高，差异有显著性意义（P<0.05）。经 Spearman相关检验，小鼠尿碘水平与碘浓度呈显著正相关（r=0.878，P=0.000）。 2)过量碘对小鼠甲状腺摄碘率的影响 灌胃20min后，与正常对照组相比，从碘浓度为3000μg/L的C组开始小鼠甲状腺摄碘率明显降低，差异有显著性意义（P<0.05）。灌胃2h后，与正常对照组A组相比，从碘浓度为1500μg/L的B组开始小鼠甲状腺摄碘率明显降低，差异有显著性意义（P<0.001)。 3)过量碘对甲状腺Tshr、Slc5a5（NIS)、Slc26a4（pendrin)、Tpo、Duox2、Iyd、Ctsb、Ctsd、Slc16a2（Mct8) mRNA表达水平的影响 过量碘明显抑制了Tshr、NIS、Pendrin，Tpo、Duox2 mRNA的表达，下调严重程度依次为 NIS、Pendrin、TPO、Tshr、Duox2，表达有显著差异（P<0.05）；而Iyd、Cstb、Cstd mRNA表达虽然有下降，但表达无显著差异（P＞0.05），对于Mct8基因，只有碘浓度为6000μg/L的D组Mct8 mRNA表达下调，表达有显著差异（P<0.05）。 4)甲状腺细胞结构受损及溶酶体数量减少 电镜结果显示，正常对照组甲状腺滤泡上皮细胞结构清晰，细胞核呈圆形或椭圆形，各种细胞器均匀分布于细胞质中，含有丰富的溶酶体。E组滤泡腔内充满电子密度高的物质，可见胶质滴，甲状腺甲状腺滤泡上皮细胞扁平，核为长椭圆形，各种细胞器模糊不清，内质网极度扩张，脱颗粒，有的融合成不规则的囊泡，线粒体数目减少，空泡化，结构模糊，溶酶体罕见。与正常对照组对比，高剂量碘组能使甲状腺甲状腺滤泡上皮细胞的结构受损和溶酶体数量明显减少。 5)过量碘对小鼠血清GSH-Px活性的影响 与正常对照组A组相比，从碘浓度为3000μg/L的C组开始小鼠血清GSH-Px活性水平明显降低，有显著性差异（P<0.05）。 3.马尾松松针提取液干预效果评估及其干预性功能食品加工工艺研究 1)与高碘组相比，空白组、对照组、干预组小鼠血清GSH-Px活性水平明显升高，有显著性差异（P<0.05）。 2)马尾松松针提取液最佳浸提工艺：料液比1:20（g/mL），浸提时间120 min，浸提温度90℃；马尾松松针提取液最佳酶解澄清工艺：水浴温度65℃，澄清时间2h，果胶酶浓度0.12%；马尾松松针抗氧化酸奶的最佳配方：以松针提取液为溶剂，脱脂奶粉质量分数14%，蔗糖质量分数7%，稳定剂明胶质量分数0.1%；马尾松松针抗氧化酸奶最佳发酵工艺：复合发酵剂添加质量分数0.12%，发酵时间为8h，发酵温度为43℃；马尾松松针抗氧化酸奶总抗氧化能力为51.31（U/mL），具有较强抗氧化能力。 结论: 1.过量碘致甲状腺胶质潴留是由甲状腺胶质合成释放异常、下丘脑—垂体—甲状腺轴调节异常、及机体抗氧化水平下降共同作用下产生的。 2.马尾松松针提取液对过量碘具有干预作用，可作为过量碘干预性功能食品的原料。 3.在最佳配方及工艺下研制的马尾松松针抗氧化酸奶具有抗氧化干预作用。
过量碘;甲状腺胶质潴留;甲状腺肿;松针提取液;功能酸奶干预
广州医科大学
硕士
营养与食品卫生学
陈骁熠
2014
中文
R581.3;R459.3
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2015-08-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）