短期应激对脓毒血症的影响及机制研究
战时创伤导致的脓毒血症是部队战斗减员的重要因素。战时人员往往处于高度应激状态，在这种情况下，机体的物质代谢、营养状况和免疫功能会发生一系列改变，从而影响机体的抵抗力，研究应激状态下的脓毒血症致死率情况和具体机制是本课题需要解决的问题。 应激状态下，机体会激活两套系统，即下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)和交感-肾上腺髓质系统(SNS)。我们知道糖皮质激素能够有效抑制炎症反应，这一原理已被广泛应用于临床；但是交感神经系统及肾上腺素能受体对免疫的调节作用，及其在脓毒症的发生发展过程中扮演的角色，是我们关注的问题。 目的： 战时创伤导致人体处于应激状态，在这种情况下，机体的代谢、免疫功能发生变化，从而影响到机体的抵抗力和营养状况。在应激条件下，我们从机体应对脓毒血症着手，研究其免疫功能的变化情况和具体的机制，为在营养学方面进行干预和支持提供新的思路和靶点。从而为解决战时创伤所需的营养支持提供理论基础和依据。 方法： 1.动物分组及喂养 Balb／c雄性小鼠，7周龄，由第二军医大学实验动物中心提供,适应性喂养7d后，根据实验需要随机分为若干组，每组8只小鼠。 2.应激动物模型的建立 采用较常用的束缚应激的方法制作短期应激动物模型，小鼠在连续三天中被束缚3次，每次3小时，在一个直径2.5cm的可以束缚小鼠动作但不会挤压小鼠的塑料圆桶中。 3.小鼠脓毒症模型的建立 7周龄雄性Balb/c小鼠，采用盲肠结扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture，CLP)方法制作脓毒症模型，观察生存率和死亡率。 4.小鼠生存时间的观察 观察小鼠生存时间，应用SAS统计软件进行Log-rank生存曲线分析，p<0.05，差别有统计学意义。 5.小鼠脾脏切除术 打开腹腔将脾脏近端的脾动脉和胃动脉用缝线系紧并打结，小心切除脾脏。 6.血浆采集 小鼠被断头处死，收集末梢血样用于细胞因子测量。 7.脾脏匀浆准备 小鼠被断头处死，脾萃取完后置于冰水水浴器中在磨珠匀质器中混匀,然后将匀浆离心(3000g,4℃,10min),取上层清液保存于-80℃环境下。 8.巨噬细胞的分离和培养 提取小鼠腹腔原代巨噬细胞，离心（4℃，250×g，10min），去上清，培养悬浮细胞，调整细胞密度至5×105/mL后接种孵育（37℃、5％C02）。2h后去除未贴壁细胞，更换新鲜培养基继续培养24h后进行后续实验。 结果： 1.短期应激对小鼠脓毒症的保护作用 1.1短期应激对脓毒症小鼠的保护作用与交感神经系统的关系 分别检测control组（未应激组）、stress组（束缚应激组）、stress+6H组（束缚应激前7天给予小鼠100mg/kg的6-OHDA损毁交感神经，然后再给予束缚应激刺激）、6H组（仅给予100mg/kg的6-OHDA）盲肠结扎穿孔脓毒血症小鼠的生存率。结果提示，采用束缚应激的小鼠的生存率高于对照组，短期束缚应激降低脓毒血症小鼠的死亡率，采用6-OHDA损毁交感神经后，该保护效应消失，提示该效应与交感神经释放神经递质关系密切。 1.2短期应激对脓毒症小鼠的保护作用与β肾上腺素能受体相关 分别检测control组（未应激组）、stress组（束缚应激组）、stress+Pro组（每次束缚前60min腹腔内注射10mg/kgβ肾上腺素能受体拮抗剂-普萘洛儿）、pro组（仅给予10mg/kg的普萘洛尔）盲肠结扎穿孔脓毒血症小鼠的生存率。结果提示，采用束缚应激的小鼠的生存率高于对照组，短期束缚应激降低脓毒血症小鼠的死亡率，采用β肾上腺素能受体拮抗剂-普萘洛儿后，该保护效应消失，提示保护效应通过β肾上腺素能受体发挥作用。 1.3短期应激降低脓毒症小鼠血液中的炎性因子 检测了control（sham）组（未应激未盲肠结扎组）、control（sep）组（未应激组）、stress组（束缚应激组）、stress+Pro组（每次束缚前60min腹腔内注射10mg/kg普萘洛儿）、pro组（仅给予10 mg/kg的普萘洛尔）、stress+6H组（束缚应激前7天给予小鼠100mg/kg的6-OHDA，然后再给予束缚应激刺激）、6H组（仅给予100mg/kg的6-OHDA）小鼠血浆中TNF-α和HMGB1的浓度。结果提示，束缚应激能够降低血液中TNF-α和HMGB1的浓度，而且这一效应能够被6-OHDA和普萘洛尔所阻断 1.4短期应激后小鼠体内去甲肾上腺素浓度提高 检测了control组（空白对照组）、stress组（束缚应激组）、stress+6-OHDA组（束缚应激前7天给予小鼠100mg/kg的6-OHDA，然后再给予束缚应激刺激）、6-OHDA组（仅给予100mg/kg的6-OHDA）脓毒血症小鼠血浆中去甲肾上腺素（NE）的浓度。又检测了control组（空白对照组）、stress组（束缚应激组）、stress+6-OHDA组（束缚应激前7天给予小鼠100mg/kg的6-OHDA，然后再给予束缚应激刺激）、6-OHDA组（仅给予100mg/kg的6-OHDA）、stress+Pro组（每次束缚前60min腹腔内注射10mg/kg普萘洛儿）、pro组（仅给予10mg/kg的普萘洛尔）脓毒症小鼠血浆中白介素-10（IL-10）的浓度。结果提示，束缚应激使血液中去甲肾上腺素浓度提升，用6-OHDA能够破坏交感神经末梢，阻断了去甲肾上腺素的释放。 2.去甲肾上腺素对巨噬细胞PPAR以及下游蛋白的调节 2.1.短期应激促进PPARγ和ArgⅠ在脾脏巨噬细胞上的表达 我们用巨噬细胞特异性标志物F4/80标记脾脏巨噬细胞。用免疫荧光法测定PPARγ和Arg1在control组（未应激组）、stress组（束缚应激组）、stress+6H组（束缚应激前7天给予小鼠100mg/kg的6-OHDA损毁交感神经，然后再给予束缚应激刺激）、6H组（仅给予100mg/kg的6-OHDA）、stress+Pro组（每次束缚前60min腹腔内注射10mg/kg普萘洛儿）、pro组（仅给予10mg/kg的普萘洛尔）小鼠脾脏巨噬细胞上的表达。结果提示束缚应激促进PPARγ和ArgⅠ在脾脏巨噬细胞上的表达，用6-OHDA破坏交感神经末端或者使用β肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔能够拮抗束缚应激的作用。 2.2.细胞实验中去甲肾上腺素能够促进PPARγ和ArgⅠ的表达 采用不同剂量的去甲肾上腺素（10-6-10-10M浓度）处理原代腹腔巨噬细胞，用免疫印迹法检测PPARγ,ArgⅠ,UCP2,PGC-1α以及HMGB1的表达。结果提示，去甲肾上腺素能够上调PPARγ，ArgⅠ,UCP2,PGC-1α的表达，且其浓度与表达呈正相关，NE能够下调HMGB1的表达，且其浓度与表达呈负相关。 2.3.细胞实验中去甲肾上腺素通过β肾上腺素能受体发挥效应 采用β肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔（10-7M）以及α肾上腺素能受体拮抗酚妥拉明作用于NE（10-8M）处理过的巨噬细胞，采用免疫印迹法观察PPARγ,ArgⅠ,UCP2,PGC-1α以及HMGB1的表达。结果提示，β肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔能够拮抗NE的效应，但α肾上腺素受体拮抗剂酚妥拉明对此并无影响。 2.4.细胞实验中PPARγ的激动剂能够模拟NE的效应 PPARγ的拮抗剂GW9662能够拮抗NE对于HMGB1和UCP2的效应，其激动剂RSG能够模拟NE的效应，上调UCP2，下调HMGB1，并且该效应能够被UCP2阻断剂Genipin所阻断。 3.PPARγ以及下游蛋白的调节对小鼠脓毒血症生存率的影响 3.1.PPARγ的拮抗剂能够阻断束缚应激的保护效应 PPARγ的拮抗药GW9662，使肝脏中Arg1、PPARγ、 UCP2、PGC-1α的表达降低，使HMGB1的表达增高，增加HMGB1在血浆的释放，阻断了束缚应激对脓毒血症小鼠的保护作用。 3.2.PPARγ的激动剂RSG具有保护脓毒症小鼠的效应 PPARγ的激动剂RSG能够上调UCP2的表达，下调HMGB1在脾脏的表达，RSG能够显著提升脓毒症小鼠的生存率，并且生存率与RSG存在剂量依赖关系，RSG能够减少血浆中HMGB1的含量。 3.3.UCP2拮抗剂Genipin(京尼平)能够阻断束缚应激保护效应 使用UCP2拮抗剂Genipin(京尼平)能够阻断束缚应激对于脓毒症小鼠的保护作用。 3.4.UCP2位于PPARγ信号通路的下游 京尼平能够阻断RSG对于脓毒症小鼠的保护作用。京尼平拮抗应激小鼠体内UCP2的表达，但并不影响PPARγ的表达。 结论： 1.短期应激能够提高脓毒症小鼠生存率，降低炎性因子。 2.短期应激的保护效应通过交感神经释放去甲肾上腺素来实现。 3.去甲肾上腺素通过激活巨噬细胞β肾上腺素能受体发挥保护效应。 4.去甲肾上腺素通过活化PPARγ，上调UCP2，调节线粒体功能，从而发挥保护效应。
战时创伤;脓毒血症;免疫功能;束缚应激;营养支持
第二军医大学
博士
营养与食品卫生学
李敏
2014
中文
R826.3
81
2015-08-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）