支气管上皮细胞与中性粒细胞混合培养诱导细胞表面粘附分子产生的机制研究
目的:1.构建支气管上皮细胞(BEAS-2B cells)和中性粒细胞(Neutrophils;NEU)混合培养体系。2.探讨支气管上皮细胞与中性粒细胞相互作用时,诱导细胞表面粘附分子表达及细胞因子(IL-6、IL-8)分泌的机制。 方法:1.采用免疫磁珠阳选法分离纯化人外周血中性粒细胞,与支气管上皮细胞混合培养,构建实验体系。2.实验随机分成6组:①:单独培养的支气管上皮细胞组(BEAS-2B组);②单独培养的中性粒细胞组(Neutrophils组);③支气管上皮细胞和中性粒细胞混合培养组(BEAS-2B+Neutrphils组);④混合培养并加入抑制剂SB203580组(B+N+SB203580组);⑤混合培养并加入抑制剂MG-132组(B+N+MG-132组);⑥混合培养并加入抑制剂SB203580和MG-132组(B+N+SB203580+MG-132组)。3.应用流式细胞术(FCM)检测BEAS-2B细胞和NEU细胞表面粘附分子(ICAM-1、ICAM-3和VCAM-1)的表达;应用western blot技术检测BEAS-2B细胞内NF-KB及p38MAPK通路的激活;应用Real-time PCR法检测上述细胞中ICAM-1、ICAM-3和VCAM-1的基因表达;应用Roche Cobas e411和ELISA技术检测细胞培养上清液中IL-6和 IL-8的分泌。 结果:1.用免疫磁珠阳选法可以分离得到纯度>98％、活力>98%的中性粒细胞。2. BEAS-2B细胞表面粘附分子的表达:BEAS-2B细胞和NEU细胞混合培养, BEAS-2B细胞表面粘附分子ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1的表达较其单独培养时明显增高;加入抑制剂后,三种粘附分子的表达均有明显减低;ICAM-3、VCAM-1对两种抑制剂的敏感程度并无明显差异,且未发现两种抑制剂间的相互作用;MG-132对ICAM-1的抑制作用明显强于SB203580,并且两种抑制剂联合使用可进一步降低ICAM-1的表达。3.中性粒细胞表面粘附分子的表达:BEAS-2B细胞和NEU细胞混合培养,中性粒细胞表面ICAM-1的表达较其单独培养时明显增高;加入抑制剂(SB203580、MG-132)表达量明显下降。4.与BEAS-2B细胞单独培养组相比,混合培养组BEAS-2B细胞ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1的基因表达水平明显上调;与单独培养NEU细胞相比,混合培养组ICAM-1的基因表达水平也明显上调。5.western blot结果显示BEAS-2B细胞与NEU细胞混合培养可以诱导BEAS-2B细胞体内Phospho-IKB及Phospho-P38MAPK蛋白的表达。6.BEAS-2B细胞与NEU细胞混合培养时,细胞培养上清液中IL-6的表达量明显增加,加入抑制剂(SB203580、 MG-132)均可抑制IL-6的分泌,且MG-132的抑制效果强于SB-203580,同时两种抑制剂联合使用有协同作用;.7. BEAS-2B细胞与NEU细胞混合培养,细胞培养上清液中IL-8的分泌无变化。 结论：1.免疫磁珠阳选法可以分离得到高纯度、高活性的中性粒细胞。2.BEAS-2B细胞与中性粒细胞接触后相互作用可活化BEAS-2B细胞内NF-KB和P38MAPK通路,进一步诱导相关基因的表达,从而调控细胞表面粘附分子ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1及炎症因子(IL-6)的表达。
支气管上皮细胞;中性粒细胞;表面粘附分子;细胞因子
解放军医学院;解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军医学院
硕士
临床检验诊断学
王成彬
2014
中文
R56
74
2015-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）