奶牛链球菌性乳房炎可视化LAMP检测方法的建立及应用
奶牛链球菌性乳房炎是奶牛乳房炎的常见类别之一。链球菌属致病菌感染奶牛乳房后所引起的临床症状不明显从而不易被牛场察觉,但链球菌性乳房炎所造成的危害却极大,最直观的经济损失是奶牛乳产量下降,牛奶品质变差。同时牛奶中的炎性因子与致病菌、毒素也对消费者健康会造成威胁。准确、快速的致病菌检测是治疗与控制乳房炎的前提,不仅能够有效降低经济损失,避免抗生素滥用,而且可减少耐药菌株出现与牛奶中的药物残留率。由于链球菌对青霉素、氨苄青霉素、万古霉素等多种抗生素均敏感且治疗效果明显,因此,开发建立一种方便快捷的检测链球菌性乳房炎致病菌的技术不仅具有较高的应用价值,是奶牛场乳房炎防控措施中的一项重要内容,同时也有着公共卫生学意义。 传统的链球菌培养要求条件高,分离鉴定难度大; PCR方法敏感、快速但依赖于昂贵复杂的精密仪器,难以在条件较差的基层推广普及使用。环介导等温扩增(LAMP)作为新型的体外核酸扩增技术,具有高特异性、高灵敏性,简便快速、成本低,对仪器设备的要求简单的特点,在临床与现场快速检测诊断方面,显示了其突出的优越性。 本试验采用环介导等温扩增可视化技术快速检测链球菌性乳房炎致病菌。针对链球菌属细菌的高保守特异性序列,延伸因子tuf基因为靶基因设计4条LAMP引物,对Mg2+浓度,反应温度,dNTP浓度等多种反应条件进行优化后,确立了25μL LAMP可视化方法的反应体系:内引物(FIP/BIP)1.2μmol/L,外引物(F3/B3)0.2μmol/L,Mg2+浓度8 mmol/L,dNTP浓度1.2 mmol/L,甜菜碱 Betaine0.8 mol/L,钙黄绿素Calcein25μmol/L,MnCl20.5 mmol/L,8 U Bst DNA聚合酶,2.5μL10×Bst Buffer,2μL模板DNA,超纯水补足至25μL。反应条件为63℃60 min后80℃灭活5 min。反应完成后肉眼观察反应管内液体的颜色变化,紫外光条件下是否有绿色荧光发出,以及高速离心后有无白色焦磷酸沉淀均能够对LAMP反应是否发生做出判断。 利用本试验所设计的LAMP引物,分别对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、表皮葡萄球菌、沙门氏菌等多种乳房炎的致病菌进行扩增,反应结果显示,只有链球菌属细菌的扩增结果呈阳性,进一步证明了LAMP反应的特异性,表明该引物能够用于链球菌属的检测。灵敏度试验表明,LAMP对无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌的DNA检出限依次为52.6 fg/μL,48.9 fg/μL,3.55 fg/μL。对于人工模拟样品,使用普通热裂解法与试剂盒法均能够获得检测结果,表明 LAMP技术对于反应所用 DNA模板质量的要求并不严格。通过对临床实际样本的检测,并与传统微生物分离鉴定法、PCR法进行比较,确定了LAMP方法的敏感性为100％,特异性分别为90.74%和96.08%,符合率为94.25%、97.70%。本试验采用在反应发生前添加荧光染料 Calcein/MnCl2,不仅能够肉眼观察反应结果,而且可有效避免SYBR Green I等传统荧光染料需在反应完成后加入、进行开盖操作,从而增加气溶胶污染的几率,避免了LAMP假阳性结果的可能,进一步提高LAMP反应的准确率。 本研究所建立的奶牛链球菌性乳房炎可视化LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高,快速高效,操作简单,检测结果直观,仪器设备要求低等特点,为乳房炎致病菌的检测提供了新的发展方向,可应用于奶牛乳房炎链球菌的检测和诊断,满足临床基层对于大批量样本进行快速检测的需求,能够有效指导奶牛场进行链球菌性乳房炎的治疗、监测与防控,对于提高乳产量、降低奶牛场经济损失、提高食品安全具有重要的意义。
环介导等温扩增;可视化检测;链球菌性乳房炎;奶牛疾病
广西大学
硕士
临床兽医学
何宝祥
2014
中文
S858.23;S857.26
90
2014-10-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）