葛根粗提物及葛根素对人肝癌SMMC-7721细胞的作用及机制
原发性肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一。此病早期即有肝内转移,并且缺乏特异性症状,难以早期发现,加之病情进展迅速,确诊时大多数患者已失去了手术机会,且绝大多数肝癌患者对放、化疗不敏感,近期疗效低,常于发病后短期内死亡。临床上在寻求和使用抗肿瘤药物的同时,发现许多化学抗肿瘤药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞,造成免疫力下降,副作用很大,且化学药品的开发费用昂贵,所以寻找既可抑制肿瘤细胞生长,促进凋亡,且毒副作用轻的非细胞毒性药物,成为研究的主要方向。因此,人们把目光转向天然药用植物,试图从天然成分中寻找毒副作用小,作用独特的抗癌药物。葛根是卫生部首批公布的药食兼用的植物之一,据世界粮农组织权威机构专家预测,葛根有望成为世界第六大粮食作物。我省大别山区葛根资源茂盛,葛根的开发可谓方兴未艾。近年来对葛根的抗癌作用研究日益广泛,国内杜德极等研究了葛根提取物对多种肿瘤的抗癌活性,发现葛根提取物对多种肿瘤均有抑制作用。目前国内外对于葛根粗提物(pueraria crude extract,CP)和葛根素(standard ofpure puerarin,SP)作用人肝癌SMMC-7721细胞,观察比较二者的体外抑瘤作用以及葛根粗提物组分群与药效间的“谱效”研究尚少。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主性的死亡过程,大量研究证明,细胞凋亡,周期紊乱与肝癌的发生、发展关系密切。因此,本课题拟采用肝癌SMMC-7721细胞为靶细胞,综合多种实验室方法,观察、了解CP和SP对SMMC-7721细胞的增殖抑制、凋亡诱导和细胞周期调控的作用,从而在蛋白水平及基因水平初步阐明其作用机制,为临床肿瘤治疗提供理论基础。 目的：1.研究葛根粗提物及其主要成份葛根素对SMMC-7721细胞增殖活力和细胞周期的影响,并比较二者的生物学效应。2.初步探讨葛根粗提物及葛根素抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导其凋亡,改变其细胞周期的机制。 方法：1.MTT法测定不同浓度CP和SP分别作用24、48、72小时后,SMMC-7721细胞生长抑制率。2.利用末端脱核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(TUNEL法)标记凋亡细胞,观察比较CP和SP引起SMMC-7721细胞的凋亡作用。3.流式细胞术分析CP和SP作用于SMMC-7721细胞后,细胞周期分布情况。4.采用细胞免疫化学方法和流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期相关蛋白表达情况。采用半定量RT-PCR法,监测细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2mRNA表达情况。 结果：1.CP和SP均可不同程度的抑制SMMC-7721细胞的生长,呈剂量-效应关系和时间-效应关系;相同条件下,CP对SMMC-7721细胞抗增殖作用强于SP,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.CP和SP作用于SMMC-7721细胞后,细胞凋亡率分别为17.04％和5.69％,CP组凋亡率高于对照组及SP组凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.CP和SP作用于SMMC-7721细胞后,G0/G1期细胞构成比分别为75.50％和60.50％,S期细胞构成比分别为12.95％和20.65％,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);且细胞增殖指数减少,CP组细胞增殖指数小于SP组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.CP和SP作用SMMC-7721细胞后,与对照组相比,CP组及SP组Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,Bax/Bcl-2比值升高,差异具有统计学意义(P<0.05),且CP组Bax/Bcl-2比值高于SP组,差异具有统计学意义(P<0.05),RT-PCR检测进一步验证了这一结果。5.CP和SP作用于SMMC-7721细胞后,P27蛋白表达增强,且CP组P27蛋白的平均荧光强度高于SP组,CyclinD1的蛋白表达减弱,且CP组平均荧光强度低于SP,差异均具有统计学意义(P<0.05)。 结论：1.CP和SP均具有抑制SMMC-7721细胞增殖的作用,且CP的抑制作用强于SP。2.CP和SP作用于SMMC-7721细胞后延长了G0/G1期,缩短了S期和G2/M期。3.CP可能通过调节Bax和Bcl-2蛋白及其mRNA的表达比例而促进SMMC-7721细胞的凋亡。4.CP和SP可能通过降低CyclinD1蛋白表达,升高P27蛋白表达,使细胞阻滞于G1期。
肝癌;葛根粗提物;葛根素;细胞周期;Bax蛋白;Bcl-2蛋白
郑州大学
硕士
营养与食品卫生学
韩萍
2009
中文
R730.52;R735.7
59
2014-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）