海洋微生物极端酶发酵条件优化及其酶学性质研究
海洋是一个十分独特的生态环境,包罗了寡营养、高盐、高压、低光照、低温(尤其深海)、无光照以及局部高温等各种极端环境。海洋微生物资源以其广阔的应用前景,促使世界各国和组织对其进行大量的研究。来自海洋的微生物大部分都适应了极端环境条件,能够产生各种独特的生物活性物质。海洋微生物的多样性丰富,已发现的类群主要包括：细菌、真菌、古菌、微藻、病毒。物种的多样性决定了其代谢产物的多样性,因此,海洋是极端生物酶的重要来源。 本文从我国天津近海盐田分离得到一株产蛋白酶的菌株SY-7,通过 16S rRNA基因序列及系统进化树分析,该菌株16S rRNA基因序列与Thalassobacillus devorans相似性为98.88%,为革兰氏阳性菌。最适生长温度为30℃、最适生长pH 7.5,最适NaCl为10%。对SY-7胞外蛋白酶经行了酶学性质研究,最适反应温度、pH值分别为45℃,7.5~9.0, 40℃具有良好的稳定性。SY-7蛋白酶基本不受反应体系NaCl的浓度的影响。EDTA,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF抑制酶活,巯基乙醇影响微弱。Ca2+、Mg2+激活作用明显,Na+、K+对酶活基本没有影响。而Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Ni+ 和Hg2+则能抑制酶活,其中Hg2+表现出强烈的抑制作用。螯合剂EDTA明显抑制酶活。利用PB设计从众多的影响因素筛选出得到影响较大的3个因素：葡萄糖含量、接种量、装液量；再利用响应面法中的杂合设计进行优化,通过拟合得到响应曲面函数,获得了最佳的实验条件。在该实验条件下酶活从870 U/mL提高到1390 U/mL,实际酶活力达到理论预测值的98.5%,优化效果较好。通过五升罐小试,在最佳试验条件下酶活可达到1230U/L。 本文对实验室先前构建的深海低温脂肪酶基因工程菌lip001进行了发酵条件优化。确定了培养基为橄榄油1%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、硫酸铵0.5%、磷酸盐0.5%、MgSO4为0.5%、氯霉素12.5μg/mL为最优发酵条件,优化后的脂肪酶活为1980 U/mL,比优化前提高了54.7%,为大规模发酵奠定了基础。采用5L发酵罐方法试验,酶活达到2420 U/mL。采用50L发酵罐方法试验,酶活达到5620 U/mL。采用500L发酵罐方法试验,酶活达到5120 U/mL。该低温脂肪酶的最适反应温度30℃,pH值为8.5~9.0,50℃及以上表现热不稳定性,具低温碱性脂肪酶性质。高浓度SDS、Tween-80、尿素、盐酸胍和EDTA抑制酶活,巯基乙醇影响微弱。Ca2+、Mg2+、Sr2+激活作用明显,Hg2+强烈抑制酶活。
海洋微生物;分离鉴定;蛋白酶;脂肪酶;发酵优化
国家海洋局第三海洋研究所
硕士
微生物学
曾润颖
2012
中文
2014-07-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）