WSSV膜蛋白VP26与核衣壳蛋白VP51相互作用位点的鉴定及低温保存WSSV病毒粒子方法的建立
对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是一种杆状型的环状双链DNA (dsDNA)病毒。由该病毒引起的对虾大规模死亡已成为影响对虾养殖业发展的主要制约因素。随着研究的不断深入,已对 WSSV 的结构蛋白有了一定了解。本实验主要包括WSSV膜蛋白VP26与核衣壳蛋白VP51相互作用位点的鉴定以及低温保存WSSV方法的建立两个方面：
(1)WSSV 膜蛋白VP26 核衣壳蛋白 VP51 之间存在着相互作用,从而将WSSV的囊膜与核衣壳联系起来。为了进一步研究VP26与 VP51之间的相互作用,我们通过免疫共沉淀的方法确定了VP26与VP51相互作用的位点。在实验过程中我们设计了一系列VP51突变体并将这些突变体克隆到载体pET28-V5上使VP51突变体融合表达V5标签；同时还将设计的一系列VP26突变体克隆到载体pET-HIS上,使VP26突变体融合表达HIS标签。然后分别将VP51突变体与VP26突变体在E.coil BL21中共表达,再利用免疫共沉淀技术以及Western Blot进行检测。
我们发现在VP26上和VP51发生相互作用的位点主要位于第156位至204位氨基酸而在VP51与VP26发生相互作用的位点位于第141位至180位氨基酸、第261位至350位氨基酸以及第431位至至466位氨基酸。通过对VP26的晶体结构分析进一步推测VP26上与VP51发生相互作用的位点主要位于第174位至182 位氨基酸。通过对 VP51 二级结构以及亲水性的预测分析发现,VP51 上与VP26具有相互作用的区域主要是由α螺旋以及无规则卷曲组成。
(2)在实验过程中,我们发现纯化的完整病毒在 4℃下保存一段时间后开始出现一定程度降解并且不同时间提纯的病毒悬液在感染力上有所差异,为了降低感染实验过程中的误差,我们尝试利用低温保存技术对 WSSV 病毒进行低温冻存。在实验过程中,我们先将不同浓度梯度(5%至20%)的DMSO或甘油作为保护剂加入到 WSSV 提取液中,在-80℃冻存 15 天后,然后通过透射电镜观察冻存病毒粒子的形态。
结果显示当使用 DMSO 做为冻存保护剂时电镜下观察到的完整病毒粒子数 量明显比不含任何冻存保护剂的阴性对照组要多,其中以10%浓度为最佳条件；当使用甘油作为冻存保护剂时电镜下只能观察到几个完整病毒,大部分病毒开始出现解聚并且甘油浓度的增加没有起到有效的保护效果。然后我们利用透射电镜观察冻存15天和30天的含10%DMSO的病毒悬液发现完整病毒粒子的数量和形态没有明显差异。
同时我们还利用荧光量PCR检测了分别感染冻存15天和30天的病毒的螯虾肌肉组织中24小时内的病毒增殖速度,实验结果显示感染了含10%DMSO的病毒的螯虾体内病毒增殖速度明显比感染阴性对照组的要快并且其增殖速度没有出现随时间减弱的现象。
对虾白斑综合症病毒;VP51;VP26;低温保存
国家海洋局第三海洋研究所
硕士
微生物学
杨丰
2012
中文
2014-07-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）