天麻素对化疗诱导痛觉过敏的抑制作用
目的：观察天麻素对长春新碱诱导痛觉过敏模型大鼠的预防及治疗作用,并研究其对大鼠脊髓背角星型胶质细胞和小胶质细胞活化以及 TNFα、IL-1β 等炎性细胞因子表达的影响,探讨其在脊髓水平的作用机制。 方法：(1) 建立化疗诱导痛觉过敏模型的方法：挑选出痛阈合格的成年SD大鼠,随机分为2组,分别为生理盐水对照组和长春新碱模型组。模型组隔日一次腹腔注射长春新碱(125μg/kg),对照组同步注射生理盐水(0.5ml/100g),以首次给药当天为第一天(D1),给药前测定一次痛阈值,给药后于第2天开始隔日做行为学实验,检测大鼠机械刺激和热刺激痛阈值。当模型组大鼠痛阈值明显降低时,即模型建立成功,记录给药总次数。(2) 行为学方法观察天麻素对化疗诱导痛觉过敏的作用：取健康SD大鼠30只,随机区组法分为5组,分别为生理盐水对照组,长春新碱模型组,小、中、大天麻素剂量组(30mg/kg,60mg/kg,120mg/kg)。首先,建立化疗诱导的痛觉过敏模型,即除对照组用生理盐水对照外,其它四组隔日腹腔注射VCR,共4次,模型建立成功后,于第9天药物治疗组开始腹腔注射天麻素,对照组和模型组用生理盐水同步对照,分别于治疗1-2周后,行为学方法检测记录大鼠的痛阈值变化。(3) 免疫组化法测定大鼠星形胶质细胞活化的状况：分组及处理方法同(2)。于末次治疗第2天,用2%戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉大鼠,然后用4%多聚甲醛对大鼠行活体灌流,取大鼠脊髓腰膨大,固定、脱水、包埋处理,并做石蜡切片,采用免疫组化SV法检测星形胶质细胞活化标志物GFAP的表达。(4)免疫荧光方法检测大鼠脊髓小胶质细胞的活化状况：分组及处理方法同(2) 。大鼠取材方法同(3),取出腰膨大后固定,蔗糖脱水,冰冻切片,免疫荧光技术检测小胶质细胞活化标志物物Iba-1的表达。(5) 酶联免疫吸附法检测大鼠脊髓IL-1β和TNFα的表达变化：分组及处理同(2)。用天麻素治疗1周后,于末次治疗第2天,大鼠用20%乌拉坦(1ml/100g)深麻醉下断头处死。取出脊髓腰膨大处,加入预冷的生理盐水,用匀浆器按1：9(W/V)的比例制成10%的组织匀浆,于4℃离心机, 3500r/min 离心10min,提取上清液于-20℃冻存待测。采用ELISA方法进行测定。(6) MTT法检测天麻素对长春新碱杀伤癌细胞的影响：将VCR按6.25、12.5、25、50、100、200、400、800μg/m l浓度加入含有乳腺癌细胞(MCF-7)的培养孔中,细胞浓度2-4×104,培养24小时,用噻唑蓝 (MTT )比色法测定OD值,计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)；将天麻素按0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5mg/ml浓度单独加入含有MCF-7的培养孔中,同时将VCR和天麻素联合用于MCF-7,培养24小时,MTT法测定OD值,计算生存率。 结果：(1) 在行为学实验中,实验第8天化疗诱导的痛觉过敏模型成功建立,用不同剂量天麻素治疗模型大鼠1周后,治疗组大鼠的机械和热刺激痛阈值与模型组比较均有不同程度的提高(P<0.05,P<0.01)。(2) 免疫组化实验中,模型组的脊髓灰质中可见GFAP表达明显增强,提示星形胶质细胞明显活化,而治疗组与模型组比较, GFAP表达明显减弱。(3) 免疫荧光实验中,模型组脊髓灰质中Iba-1表达明显增强,提示小胶质细胞明显活化,治疗组与模型组比较,Iba-1的表达均有不同程度的减弱,表明天麻素可抑制小胶质细胞的活化。(4)在酶联免疫吸附实验中,实验第 8 天痛觉过敏大鼠模型成功建立,用不同剂量天麻素治疗后,与模型组比较,治疗组大鼠的IL-1β和TNFα的表达明显降低(P<0.01)。(5)在观察天麻素对长春新碱杀伤癌细胞作用的影响实验中,天麻素单独加入含有MCF-7的培养孔后,对其生长无显著的影响(P>0.05),天麻素和长春新碱同时加入含有MCF-7的培养孔后,天麻素对VCR杀伤癌细胞作用无显著影响 (P>0.05)。 结论：天麻素可减轻长春新碱诱导的大鼠痛觉过敏反应,其减轻化疗诱导痛觉过敏反应的机制,可能与其抑制脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞的活化及抑制痛觉过敏大鼠脊髓IL-1β和TNFα的表达有关。天麻素对长春新碱杀伤MCF-7无明显影响。
天麻素;长春新碱;化疗;痛觉过敏
三峡大学
硕士
药理学
郑卫红
2013
中文
R96
2014-07-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）