用于CHO大规模表达的质粒载体的构建鉴定及相关工作建立
目的：本研究的目的是建立一个哺乳动物细胞表达系统,能够高效表达外源目的蛋白,为将来应用于表达药用重组蛋白提供基础：对CHO细胞表达系统表达外源蛋白的上游转染、筛选条件和检测方法进行探索和优化,并构建适用于CHO细胞大规模表达的、能提高外源蛋白表达效率的通用载体,并对该载体进行初步的检测。 方法：本研究对CHO细胞株的脂质体转染条件和G418筛选条件进行优化研究、并用基因组PCR、RT-PCR、dot-ELISA、间接ELISA、细胞免疫荧光和MTT法对由该CHO表达系统表达的分泌型蛋白如分泌型bFGF的表达进行检测；根据文献报道,通过半巢式PCR方法,从CHO基因组中分离出抗阻遏子元件,克隆到pIRESneo3载体真核转录本的两侧,构建成一个通用载体,然后采用分泌型bFGF、绿色荧光蛋白等作为报道基因,通过筛选后克隆计数、MTT测活法和荧光强度对比等方法对该表达载体进行初步的研究和检测。 结果：24孔板中CHO/dhfr-的最佳转染条件为脂质体2μg和DNA2μl,G418最佳筛选条件为500μg/ml；转染后,检测到外源基因整合到基因组,并检测到该基因的转录,MTT法间接检测到该基因的分泌表达：从CHO细胞基因组中分离得到的抗阻遏子元件与文献报道有97%同源；成功构建了pInAR2质粒载体,检测到抗阻遏子元件对外源基因的表达有增强作用。 结论：本研究对CHO细胞表达系统高效表达外源蛋白进行了初步的研究和条件的确立；构建了一个含有抗阻遏子元件的质粒型通用载体,该载体能够提高报道基因的定向整合效应,促进报道基因的表达,是一个很有应用前景的哺乳动物细胞表达载体,为进一步研究CHO细胞大规模表达重组蛋白提供了基础,对较广泛地应用于重组药用蛋白的表达具有重要的意义。
CHO;大规模表达;抗阻遏子元件
暨南大学
硕士
遗传学
洪岸
2005
中文
Q782
2014-05-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）