系统性红斑狼疮及肾移植急性排斥反应中转录因子活性差异的分析
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及全身多个系统的难以预料的自身免疫性疾病,其最常见和最严重的并发症为狼疮性肾炎(Lupus nephritis),临床统计SLE患者中有肾损害的达到95%,而病理活检结果更是接近100%。自从糖皮质激素与免疫抑制剂被用于治疗SLE后,患者的预后虽已经有明显改善,但总的来说该病治疗现状仍不容乐观,有约15%的患者在发病5年内死亡和出现肾功能衰竭,同时复发也是治疗过程中面临着的一个严峻问题。而肾移植是目前终末期肾病患者最理想、最经济的一种治疗方法,但移植后急性排斥反应严重影响着移植物及受者的存活。目前,移植肾活检是能明确诊断排斥反应的唯一方法,但此法即昂贵又不方便还易引起肾损伤导致各种并发症。因此新的有效、方便的SLE和排斥反应早期生物标记的发现,将能大大提高SLE与肾移植治疗效率。在此方面研究人员做了大量工作,当前临床上治疗SLE普遍采用糖皮质激素和/或免疫抑制剂从整体抑制机体的免疫功能,对该病存有的免疫功能紊乱可谓是没有目标性,缺乏靶向性。同时这些药物副作用大,很多患者由于副作用而被迫停药,致使治疗中断。在排斥反应方面,主要方向为使用先进的科学技术从蛋白尿和患者外周血中寻找排斥反应的早期生物标记,但目前这些研究成果都还未能运用于临床上转录因子(Transcription factor,TF)又称为反式作用因子,是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白,通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用,激活或抑制转录。一个转录因子可调控数百个基因的表达,而一个基因的表达又可受数个转录因子的调控。转录因子的结构和功能缺陷,与人类的一些疾病(如肿瘤和炎症)相关,许多转录因子还是药物作用的靶点。新的生物标记能及时、可靠、特异地预示SLE患者和移植物的趋势,有助于进一步阐述SLE和排斥反应的发生机制。本研究的目的在于应用转录因子芯片技术,筛选在SLE和肾移植急性排斥反应中活性差异表达显著的TF,进一步探讨TF在SLE和肾移植急性排斥反应中的作用机制。研究材料与方法：1.10例取自健康自愿者外周血的单个核细胞为正常细胞对照组,15例取自SLE患者外周血的单个核细胞为SLE细胞实验组；取3例自肾肿瘤切除术中远离肿瘤组织且病理检查正常的肾皮质做为实验组织对照组,3例肾移植急性排斥反应患者肾穿标本做为肾移植急性排斥组。2.按照试剂盒说明抽提细胞核蛋白,bradford法用蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度,定量后分装,-80℃冻存。3.标记所提取总核蛋白中的TF,浓缩标记样品,采用TranSignalTM Protein/DNA Array试剂盒进行TF芯片杂交。4.通过X胶片曝光,使用Genepix 4000B进行图像扫描,并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存；采用ScanAlyze软件分析数据,分析结果导出,最终用EXCEL文件表示。5.电泳迁移率变动分析(EMSA)实验验证芯片结果。实验结果：1.所提取的细胞核蛋白经过定量检测符合芯片实验需求。2.SLE细胞实验组和对照组芯片研究结果发现92个TF差异表达显著,其中78个表达显著上调,14个表达显著下调。3.利用芯片比较分析急性组织排斥组和对照组TF表达,发现99个TF差异表达显著。其中95个表达显著上调,4个TF表达显著下调。4.筛选SLE细胞实验组和急性排斥反应组中差异表达显著的AP-1,Pbx1和MEF-2转录因子进行电泳迁移率变动分析实验研究,其结果均符合芯片分析结果。实验结论：1.微阵列芯片是有效的高通量分析SLE及肾移植急性排斥反应TF差异表达的研究手段。2.使用芯片筛选出92个在SLE患者中差异表达显著的TF；99个在肾移植急性排斥反应中差异表达显著的TF,证实TF在SLE和肾移植急性排斥反应中出现显著的差异表达。3.用电泳迁移率变动分析实验对所挑选的3个TF进行定量表达研究,其结果与芯片结果一致,证实了芯片结果的可靠性。电泳迁移率变动分析实验是检测单个TF表达水平的有效手段。TF有可能是SLE和肾移植急性排斥反应的新的有效生物标记。差异表达TF的研究有助于进一步了解SLE和肾移植急性排斥反应发生的分子机制。
系统性红斑狼疮;肾移植;急性排斥反应;TF表达;TF芯片
广西师范大学
硕士
生物化学与分子生物学
赵丰丽
2010
中文
R593.241
2014-05-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）