人C-反应蛋白的分离纯化及初步应用
C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是人类最重要的急性时相反应蛋白之一,主要在肝脏中合成。CRP的正常合成速度为1~10mg/d,循环中的半衰期为19h,在正常人群中的浓度较低,新生儿为0.1~0.6mg/L,成年人为0.4~5.2mg/L。CRP在炎症、感染、组织损伤或恶性肿瘤等发生后的6~8h迅速升高,24~48h达到峰值,急性期浓度甚至可以升高成百上千倍,其升高的幅度与病情的严重程度呈正相关,且不会受到放疗、化疗、药物等因素的影响。CRP虽然不具有病种专属特异性,但是比WBC、IL-6等传统的检测项目更加灵敏可靠。CRP已经作为临床检测的常规项目之一,检测血清CRP含量对许多疾病的早期诊断、辅助诊断、疗效观察及判断预后具有重要意义。CRP的测定方法主要有胶乳凝集法,放射免疫法,免疫扩散法,免疫电泳法,金标法,酶联免疫法,免疫比浊法等。其中,免疫透射比浊法发展十分迅速,能够在全自动生化分析仪上实现自动检测分析,应用越来越广泛。目前,国内检测CRP所使用的免疫透射比浊试剂盒以进口为主,价格昂贵,检测成本高,在一定程度上限制了其推广应用。自主开发一种经济实用、性能可靠的CRP免疫透射比浊定量检测试剂盒,具有十分重要的意义。与单克隆抗体相比,多克隆抗体的亲和力更高,成本更低,制备方法更加简单,缺点是制备时对抗原纯度要求非常高。兼顾试剂成本、试剂性能及技术要求,所以免疫比浊试剂中的抗体多使用多克隆抗体。如果使用单克隆抗体则需要进行配对及胶乳增敏,技术要求更加高。商品抗原通常具有很好的性能,但是价格十分昂贵。鉴于CRP的重要性,为了满足研究与生产的需要,本研究拟建立一种从临床血清样本中分离纯化人CRP的方法。自提CRP初步应用于制备多克隆抗体,运用制备的抗体建立CRP免疫透射比浊定量检测方法。方法：1.对CRP单克隆抗体进行蛋白含量测定,效价测定,相对纯度分析和特异性测定。2.从医院收集CRP高浓度(>；100mg/L)的临床血清样本,运用饱和硫酸铵沉淀总蛋白、运用DEAE离子交换层析初步分离、运用制备的单克隆抗体亲和层析柱进一步精制纯化目的蛋白,并进行鉴定。3.以自提高纯度CRP作为抗原免疫山羊制备多克隆抗体,采用正辛酸-硫酸铵法进行纯化,并进行鉴定。4.运用制备的CRP多克隆抗体,建立CRP免疫透射比浊定量检测方法,并进行方法学评价试验。5.从医院收集临床血清样本,运用研制的试剂进行测定。结果：1.CPP单克隆抗体的检测结果如下：蛋白浓度为0.5mg/mL,ELISA效价为1：2560,SDS-PAGE电泳后凝胶扫描显示其相对纯度为96.2%,能够与商品CRP抗原发生特异性结合。2.从2mL临床血清样本能够分离纯化获得0.1mgCRP。SDS-PAGE电泳结果显示产物中出现相对分子质量为23kD的条带,凝胶扫描显示其相对纯度为93.1%,能够与CRP单克隆抗体发生特异性结合,与商品抗原有很好的可比性。3.运用自提CRP成功制备出CRP多克隆抗体,纯化后抗体的总蛋白含量为36.3mg/mL,ELISA效价为1：256000,SDS-PAGE电泳后凝胶扫描显示其相对纯度为91.4%,能够与CRP抗原发生特异性结合。4.运用制备的CRP多克隆抗体初步建立起免疫透射比浊定量检测CRP的方法。CRP浓度在3.1~150.0mg/L范围内线性良好,检测限为0.4mg/L,重复性、稳定性及抗干扰能力均比较好,与进口试剂有很好的可比性。5.临床测定结果如下：健康体检组(n=50)CRP浓度为6.7±1.3mg/L,风湿疾病组(n=113)CRP浓度为81.4±41.9mg/L,两组结果存在显著差异。结论：1.成功建立了一种从临床血清样本中分离纯化人CRP的方法。2.自提CRP可以用于制备抗体,成功制备出效价高、特异性强的羊抗人CRP多克隆抗体。3.制备的CRP多克隆抗体可以用于建立CRP免疫透射比浊定量检测方法,评价结果显示各项性能指标均比较好,可用于临床测定。
C-反应蛋白;离子交换层析;亲和层析;多克隆抗体;免疫透射比浊法
广西师范大学
硕士
生物化学与分子生物学
秦新民
2010
中文
Q51
2014-05-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）