肠道沙门氏菌SM1中lsrK基因的克隆及功能研究
群体感应(quorum sensing,QS)是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种生理行为,即细菌通过特定信号分子监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化,进而调控菌体中相关基因的表达,可分为种内的群体感应和种间的群体感应。近年研究发现,细菌种间群体感应普遍存在于各类动植物致病菌中,降解其信号分子——2-型自诱导子(Autoinducer-2,AI-2)对致病菌的毒力和生物膜形成有重要影响。目前对AI-2的研究已证实,不同类型的AI-2分子通过甲硫氨酸循环的分支途径合成,均以4, 5-二羟基-2, 3-戊二酮(DPD)为核心结构,而AI-2的降解途径尚不明确,普遍认为在少数肠道沙门氏菌中存在AI-2激酶LsrK,能够磷酸化AI-2和DPD,形成P-DPD后被LsrG降解。因此,对AI-2降解基因的研究,有助于了解其生物合成和降解的途径和机制,为基于QS系统的抗微生物治疗奠定基础。本论文以一株临床分离的的对人畜具有强致病性肠道细菌SM1为对象,首先根据细菌对不同碳源代谢的差异,以Biolog微生物自动鉴定系统进鉴定为猪霍乱沙门氏菌,其可能性为99%,并以16S RNA进行了进一步的验证,发现其与大多数肠道沙门氏菌16S RNA同源性为98%或97%,说明SM1不属于任何已报道过的菌种。然后将其接种到LB培养基中,取不同时间的发酵液分析,发现该菌不仅具有AI-2降解能力,自身也产生AI-2信号分子,3小时左右AI-2浓度达到最高,并在对数生长初期迅速降解了大部分的AI-2。接着,通过Baylis–Hillman反应,以特丁基二甲基硅烷乙醛和3-丁烯-2-丁酮为底物,经过三步反应化学合成了DPD,以TLC和HPLC-MS进行了验证,并建立了以哈氏弧菌BB170为指示菌的生物检测法和以邻苯二胺进行衍生化反应的化学检测方法。在寻找降解相关基因过程中,首先通过生物信息学方法分析具有降解功能的lsrK基因,构建简并引物,以PCR扩增SM1中lsrK基因的保守区域；再通过两步法半随机PCR扩增lsrK基因非保守区域,获得了该菌中lsrK的完整序列。经测序比对,发现此株肠道沙门氏菌中lsrK基因与E.colli K12中同源序列相似性为99%。然后,采用分子克隆技术,构建了lsrK基因的过表达菌株(SM1-pGEX-OlsrK)和插入重组突变株(SM1-lsrK-Gm),对比研究了三株菌的生长以及AI-2的合成情况,并收集对数生长期的菌体以人工合成的DPD为底物在无碳培养基中进行发酵。结果表明,与野生菌株相比,在LB培养基中过表达菌株细胞浓度略高,而插入突变菌株细胞浓度略低；三株菌产生AI-2的情况并无显著差异。但是它们对DPD的降解不同,lsrK基因的过表达菌株比野生型菌株对DPD的降解更快,证实了该菌种中的LsrK激酶能够能将DPD磷酸化,使其被进一步降解；lsrK基因突变株的降解速度没有显著变化,证明了在SM1中经过lsrK基因的AI-2降解途径并非唯一,在该沙门氏菌中存在与lsrK具有相同功能的其它基因,或者AI-2还存在其它的代谢途径。
肠道沙门氏菌SM1;lsrK基因;AI-2;DPD
上海交通大学
硕士
生物化工
彭华松
2010
中文
Q93
2014-05-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）