淫羊藿苷对EAE模型鼠的治疗作用及其对HPA轴的影响
背景: 多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种常见的中枢神经系统白质脱髓鞘性疾病。其症状复杂,多呈反复发作、进行性加重、高致残率等特点。大剂量甲泼尼松龙(methyl prednisolone,MP)等对缓解症状有明显疗效,但目前尚无公认有效的可以阻止复发进展的治疗药物,且大剂量糖皮质激素(glucocorticoid,GC)可导致骨质疏松、股骨头坏死、上消化道出血等严重不良反应。国内外研究证实MS多发于女性,且复发进展与雌激素水平密切相关,补充雌激素有益于病情复发的控制,且对GC具有正性调节作用,但存在引发肿瘤、降低免疫力、血栓性疾病的风险。因此,本研究以雌激素作用途径为切入点,选择雌激素和确认具有雌激素作用的淫羊藿苷(Icraiin,ICA)为治疗药物,通过对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型神经损害、病理、细胞因子、激素水平以及相关受体蛋白的表达,探讨药物的疗效差异及剂量相关性,以及疗效与下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴的关系。 目的: 构建MS的实验动物模型—EAE小鼠模型,通过雌激素、雌激素受体抑制剂及不同剂量的有雌激素样作用的ICA对EAE小鼠的治疗,从临床症状评分、免疫机制相关的细胞因子、组织病理学改变等方面探讨ICA对EAE的治疗作用及量效关系;从外周血、靶器官、中枢等方面的分子水平、蛋白水平等多层面分析不同剂量ICA对HPA轴相关激素表达水平的影响;通过对不同剂量ICA作用下内源性雌激素水平的检测,研究ICA雌激素样作用;并且通过对ER拮抗剂组与其他组别对比,研究ICA对EAE的治疗作用,并探讨这种治疗作用和HPA轴的激活的关联性。为植物雌激素治疗MS及新药的开发奠定实验基础。 方法: 1、将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55)稀释成600ug/ml,然后稀释液与等量的完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant,CFA)(灭火结核分枝杆菌的终浓度为5mg/ml)混合作为抗原,接种于C57BL/6小鼠双侧侧腹壁及脊柱两侧皮下(分四点,每部位50ul),免疫后第7d加强免疫1次(等剂量MOG/CFA)。在免疫后第0及48h腹腔内注射500ng百日咳毒素,诱导小鼠EAE模型。 2、将EAE发病小鼠按神经损伤症状评分随机分成8组,每组至少6只。分别分为A组急性组,在发病高峰期处死;B为模型对照组,让其按自然病程发展;C为雌激素组,予以己烯雌酚0.2mg/kg.d灌胃;D为ICA大剂量组,予以ICA300mg/kg.d灌胃;E为ICA中剂量组,予以ICA150mg/kg.d灌胃;F为ICA小剂量组,给予50mg/kg.d灌胃;G为ICA加ICI182,780组,给予ICA150mg/kg.d灌胃加ICI182,7801mg/mouse.d皮下注射,M为空白对照组,给予模型鼠等容量0.5％羧甲基纤维素钠混悬液灌胃;N为正常对照组,予等容量0.5%羧甲基纤维素钠混悬液灌胃。免疫接种后第9天开始陆续发病,第14天左右达到发病高峰期开始给药,连续给药5天。于免疫前一天开始每天称重,并于免疫第9天开始观察小鼠神经系统症状并评分,根据评分情况进行分组,给药。约14天时将急性组处死取材,于19天左右将灌胃各组处死,约40天时将模型对照组(B组)处死,采集血标本及脑、脊髓等组织标本。 3、取小鼠脊髓腰膨大进行HE染色,用Luxol Fast Blue(LFB)法髓鞘染色;用3’末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法(Terminaldeoxynucleotidyl teansferac-mediated Oridine3’-Tri-phosphatebiotin Nick End Labeling,TUNEL)观察脊髓组织的细胞凋亡情况;对脑组织进行匀浆,提取蛋白,用蛋白印迹法(Western-blot,WB)检测脑组织中糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的表达情况。 4、采血并以酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清中白细胞介质-17A(interleukin-17,IL-17A)含量。并用放射免疫法测定血清中皮质酮(corticosterone,CORT)的含量。 5、对药物治疗各组小鼠和模型组、空白对照组小鼠进行临床症状评分、体重称量、炎性病灶凋亡细胞计数、细胞因子含量、激素含量等进行综合分析,评估比较不同剂量ICA与雌激素对EAE的疗效,以及ER拮抗剂对ICA疗效的影响。并对各组小鼠的疗效和GR表达进行相关性分析。 结果: 1、建立的EAE模型小鼠,所表现出的神经功能损害症状、HE染色、脊髓腰膨大处的髓鞘染色,均符合典型EAE模型的病理和临床特征,模型对照组(B组)有缓解-复发现象。 2、雌激素组(C组)、ICA大剂量组(D组)、ICA中剂量组(E组),治疗后体重均比治疗前增加,但无统计学意义。ICA小剂量组(F组)体重明显减轻且差异有统计学意义,P<0.01;中剂量ICA+ICI组(G组)治疗后体重也有减轻,但P>0.05;治疗后临床症状评分B、C、D、E各组都有下降,以C组和D组下降最为明显,ICA小剂量组(F组)评分均值保持基本不变,D组和F组评分比较差异明显,P<0.01。空白对照组(M组)和G组症状评分则升高。 3、脊髓细胞凋亡图片观察到一些现象,神经细胞凋亡数目排列顺序依次为:模型对照组(B组)>ICA小剂量组(F组)>ICA大剂量组(D组)>正常对照组(N组),但因样本数目过少,无法统计。 4、IL-17A的水平:与正常组相比各模型组都有升高,以A、B、G升高具有显著差异,P<0.05;而C、D两组较A、B、G三组比均明显降低,且C组比G组降低更为明显,且P<0.05,差异有统计学意义。而E组和G组比,虽有降低,但差异无统计学意义。IL-17A浓度和治疗前后评分差值呈负相关(r=-0.8581,P=0.0288)。 5、同样临床症状缓解明显的C组和D组,CORT水平却差异甚大。和正常对照组比较C组升高,而D组则下降,C组和D组比较,P<0.0001。D组CORT水平和IL-17A水平呈单向正相关(r=0.812,P=0.0496)。 6、脑组织中GR蛋白表达水平:与正常对照N组比较,A、B、C、D、E、M各组都有升高,以B、C、D、M各组升高更为显著,P<0.01;与M组(空白对照组)相比,除G组降低之外其余平均值都升高,但仅C组升高较明显,P<0.05;G组和E组比较有所降低,但无统计学差异。以上各统计数据均以双侧P<0.05为有统计学意义。 结论: 1、ICA对EAE模型鼠的神经损害具有改善作用,且呈一定的剂量依赖性。ER拮抗剂可使ICA的治疗作用减弱。 2、大剂量ICA对炎性细胞因子IL-17A具有降低作用,表明大剂量的ICA具有明显的抗炎作用。 3、ICA可增高脑组织GR的表达,但模型鼠血CORT含量降低,表明其可能具有促进HPA轴的功能,提示其在临床应用中一定剂量的ICA与糖皮质激素治疗可能具有协同作用。 4、ICA治疗作用可能机制是与ER结合,其拟雌激素样作用直接发挥抗炎作用;或是通过促进HPA轴的功能,从而增强机体抗炎和免疫抑制功能。
实验性自身免疫性脑脊髓炎;淫羊藿苷;下丘脑-垂体-肾上腺轴;药效学;动物模型;炎性细胞因子;免疫抑制
广东药学院
硕士
内科学
洪铭范
2013
中文
R285.5;R744.5
75
2014-04-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）