利用多种细胞筛选抗氧化物质方法的研究
研究背景： 随着现代工业的发展,环境污染日益严重,日常生活中接触的氧化应激源的种类和频率较之前有大幅增加。氧化应激机制及防护成为近年来保健品和个人护理用品领域的研究热点。外源性的多种氧化应激源会攻击生物分子、蛋白、脂质或核酸,造成细胞的氧化损伤,直接或间接地导致多种病理反应的出现。紫外线照射和化学污染物造成的氧化应激与皮肤的老化、色素沉着、炎症及多种疾病的关系已得到充分的证明。许多化妆品公司推出了多种宣称可以清除氧化自由基、延缓皮肤衰老的产品,但对其是否能达到宣称的效果至今尚无标准化的评价方法。另一方面,从植物提取物、化学合成、生物转录等途径获得的活性原料也需要建立一套科学高效的筛查方法。本研究旨在建立标准化的细胞氧化损伤快速检测方法,用于化学物或化妆品的抗氧化功效性评价。 目前,对于氧化反应机制的认识尚未完全明确,但可以认为氧化损伤涉及多通路和多基因联合作用的复杂生物学过程。其中氧化损伤过程中的一些重要的靶细胞、限制酶、中间体和产物是关键的筛查指针和标志物。因而可根据氧化反应的生物学机制建立抗氧化合物检测和筛查的方法。抗氧化物质研究方法可归纳为动物模型法、人体评价法、化学检测法和细胞法四种,各有其特点和不足。特别是在提倡动物福利、避免不必要的动物实验的背景下,建立科学、高效和快速的方法是优先选择。本研究以多种细胞作为实验对象,模拟夏日日光辐射类型诱发细胞的氧化损伤模型,建立快速筛查方法。以正常皮肤HaCaT角质细胞系、原代人皮肤成纤维细胞为对象,通过对紫外线照射细胞后引起氧化损伤的多种生物标志的检测判断物质的抗氧化性;以H2O2诱导Coca-2细胞产生氧化应激,判断物质的对于不同细胞类型是否具有相同的抗氧化性;同时,使用Episkin皮肤模型,对该模型能否应用于抗氧化物质的筛选进行了初步探索。 研究目的： 以体外培养的HaCaT角质细胞、原代人皮肤成纤维细胞、Coca-2细胞和Episkin皮肤模型为对象,分别造成紫外线及H2O2诱发的细胞氧化应激模型,通过监测添加待测物质后细胞凋亡情况、细胞周期阻滞情况、活性氧族(ROS)水平和超氧化物岐酶(SOD)水平的检测,建立利用多种细胞筛选抗氧化物质的方法,提供抗氧化特性的预测和评价。 研究内容与方法： 1、细胞培养: HaCaT细胞:使用MEM培养基,加入10％的新生牛血清;原代人皮肤成纤维细胞:使用DMEM培养基,加入10%的胎牛血清;Coca-2细胞:使用DMEM培养基,加入12%的胎牛血清;Episkin皮肤模型:使用MEM培养基。为皮肤模型自带培养基。细胞定量接种于75cm2培养瓶或直径为65mm培养皿中;皮肤模型使用12孔细胞培养板培养。培养条件均为37℃、5%CO2培养箱中培养。 2、筛查物质: POCI:植物提纯物,主要成分为原花青素;LBPC:植物提纯物,主要成分为枸杞多糖;FFNT:化学衍生物;C36D:化学衍生物。 3、氧化损伤模型及筛查物质细胞毒性暴露剂量确定:使用MTT法分别测定不同紫外线辐照剂量对HaCaT细胞、原代人皮肤成纤维细胞和皮肤模型的细胞存活率的影响;测量不同浓度的H2O2对Coca-2细胞存活率的影响,确定试验辐照剂量及H2O2浓度。测定各待测物质的细胞毒性剂量,为试验提供浓度剂量选择依据。 4、抗氧化特性筛查:分别用紫外线或化学物诱导细胞产生氧化应激,分别加入筛查物质,通过监测不同的指标预测筛查物质的抗氧化特性。试验设立空白对照组,模型组,抗坏血酸组阳性对照组和待测物质组,其中HaCaT细胞和原代人皮肤成纤维细胞检测了4种物质,Coca-2细胞检测了2种物质。 4.1、氧化应激细胞损伤的检测指标:用荧光探针(DCFH-DA)标记ROS的方法测定细胞内ROS的生成情况,使用酶生化法测定SOD的水平,使用PI荧光染料标记法测定细胞周期,使用Annexinv/PI双染法测定细胞凋亡。选用抗坏血酸为阳性对照,用以评价待这四项指标是否稳定且敏感。 4.2、氧化损伤作用筛查:紫外线及H2O2造模后,分别检测加入待测物质进行干预后上述的四项指标,对各指标变化进行评价,考察待测物质是否能够对氧化应激产生拮抗作用,并评价物质的抗氧化能力的强弱。为对待测物质抗氧化特性及强度的预测提供依据。 5、统计方法:各实验组数据均以均数±标准差表示,采用SAS9.0统计软件进行分析。多组之间差异的比较用单因素的方差分析,组间两两比较用SNK检验法,显著性水平α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。使用ModfitLT软件对细胞周期结果进行分析。 研究结果： 1、氧化损伤模型的建立: 本研究建立的多种细胞氧化损伤模型,对于皮肤细胞或组织采用紫外线照射法,对肠上皮细胞采用化合物暴露法。当UVA剂量为5J/cm2,UVB剂量为0.6J/cm2时,能够抑制20%的HaCaT细胞生长;当UVA剂量为8J/cm2,UVB剂量为1J/cm2时,能够抑制20%的原代人成纤维细胞生长;当H2O2浓度为150μmol/L时,能够抑制20%的Coca-2细胞生长,在上述剂量下,细胞产生一定氧化应激损伤,但仍保持一定的增殖活力,适合进行下一步试验。 当UVA剂量分别为0J/cm2,5J/cm2,15J/cm2,25J/cm2,35J/cm2,45J/cm2时,UVB剂量约为0J/cm2,1J/cm2,3J/cm2,5J/cm2,7J/cm2,9J/cm2时,Episkin皮肤模型中细胞存活率存在剂量反应关系。 2、待测物质细胞毒性剂量确定: 对物质抗氧化性的研究应建立在其对细胞无毒性作用的浓度范围内。对于HaCaT细胞,抗坏血酸在100μmol/L,POCI在50mg/L,LBPC在400mg/L,FFNT8mg/L,C36D90mg/L浓度时可以抑制约10%细胞的增殖;对于原代人成纤维细胞,抗坏血酸在100μmol/L,POCI在50mg/L,LBPC在300mg/L,FFNT在6mg/L,C36D在90mg/L浓度时可以抑制约10%细胞的增殖;对于Coca-2,抗坏血酸在100μmol/L,POCI在50mg/L,LBPC在300mg/L浓度时可以抑制约10%细胞的增殖。 3、抗氧化损伤作用评价 3.1、ROS荧光强度水平 抗坏血酸作为阳性对照,其能够明显降低添加物质组的ROS荧光强度水平。对于HaCaT细胞,抗坏血酸组,POCI组及LBPC组细胞ROS水平较空白对照组高,但较模型组低,FFNT组及C36D组细胞ROS水平与模型组无差异,且较空白对照组高;原代人成纤维细胞经过紫外线辐照后,其ROS水平高于其余两组细胞,并且其本底的ROS水平较高,抗坏血酸,POCI及LBPC均能较模型组降低ROS水平,FFNT组及C36D组细胞内ROS水平与HaCaT细胞类似;在Caco-2细胞中,抗坏血酸,POCI及LBPC均能较模型组降低ROS水平。LBPC组的ROS水平普遍高于POCI及抗坏血酸组。 3.2、SOD结果 添加抗坏血酸,POCI及LBPC物质能够帮助HaCaT细胞及原代人成纤维细胞升高胞内SOD水平,从而达到清除ROS,拮抗氧化损伤的目的,而FFNT及C36D不能升高上述两种细胞内SOD水平。Caco-2细胞的本底SOD值较高,但其添加物质组的SOD水平变化趋势与其余细胞一致。 3.3、细胞凋亡结果 三种细胞均显示了氧化应激对细胞凋亡的影响。两种细胞系的模型组,早期凋亡的细胞所占比例较大,而原代细胞中,中、晚期凋亡的比例大于早期凋亡的细胞;在其余组别中,存活细胞占绝对多数,凋亡各期细胞比例较小。三种细胞中所添加的抗坏血酸,POCI及LBPC均能抑制细胞凋亡的发生;FFNT组及C36D组导致HaCaT细胞及原代人成纤维细胞中、晚期凋亡细胞所占比例较高,较模型组比例更高。FFNT及C36D由于有抑制成纤维细胞的作用,故而原代人成纤维细胞的中晚期凋亡细胞所占比例为绝对多数,与HaCaT细胞存在一定差异。 3.4、细胞周期结果 模型组中,三种细胞均发生了G0/G1期阻滞,其中以两种皮肤细胞的阻滞最为明显。Caco-2细胞的模型组,与同种细胞其余各组G0/G1期细胞相比,差异不大,但G2期明显降低。在添加抗坏血酸,POCI及LBPC组,三种细胞的各周期指标与空白对照组接近;而FFNT及C36D对紫外诱导后HaCaT细胞及原代人成纤维细胞的各周期指标影响不大,与模型组差异不大。 研究结论： 1.本研究根据不同应激源的损伤机制,分别建立了紫外线损伤角质细胞、成纤维细胞和三维皮肤替代物的氧化应激模型,建立了过氧化氢损伤肠上皮的氧化应激模型。结果表明在IC20的紫外线剂量下和化合物暴露剂量下可诱导多种细胞的氧化应激模型,用于抗氧化剂的筛选。 2.本研究根据筛查物的预期用途检测了4种不同化合物,结果提示:在紫外线诱导氧化应激模式下,可以使用HaCaT细胞和原代人皮肤成纤维细胞对物质进行抗氧化剂筛检,使用4种指标能够综合判断物质的抗氧化特性,而仅使用ROS水平及周期指标也可以初步判断物质是否具有抗氧化属性。在H2O2应激模式下,由于氧化应激通路的差异,提示采用ROS、SOD水平及凋亡指标可初步判断物质是否具有抗氧化特性。 3.本研究根据筛查物的理化特性建立了不同的筛查系统,用于不同实验物质的评价。细胞模型适宜用于原料、化合物和可溶性配方的筛检,皮肤模型适宜用于原料、配方及成品的检测。 4.本研究结果提示低剂量紫外线辐射可以促进HaCaT细胞和原代人皮肤成纤维细胞生长,推测可能与细胞的代偿性增生有关,确切机制有待进一步研究。
抗氧化物质;细胞周期;活性氧族水平;超氧化物岐酶;紫外线;过氧化氢
广东药学院
硕士
流行病与卫生统计学
谈伟君;程树军
2013
中文
R181
97
2014-04-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）