GeXP多基因遗传表达系统检测人TCRVα和TCRVβ链CDR3谱型及长度的方法建立以及初步应用
目的:利用GeXP多重基因表达系统建立两种多重逆转录-聚合酶链式反应(mRT-PCR)的方法,分别检测TCRVα和TCRVβ链的CDR3谱型及长度,用于分析T细胞克隆增殖情况。分析肺癌患者胸水中TIL的TCRVα和TCRVβ家族的克隆增殖情况,并克隆具有寡克隆或单克隆增生现象的TCRVα和TCRVβ基因构建重组嵌合型腺病毒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ。研究此TCRVα和TCRVβ基因修饰的PBMC对不同肿瘤细胞的杀伤作用,确定是否为肺癌相关的TCR基因,为以后发现肿瘤特异性TCR基因并利用特异性TCR基因修饰T细胞进行过继免疫治疗打下基础。 方法: 一、收集正常人外周血,分离出单核细胞,提取总RNA,利用GeXP多重基因表达系统建立多重逆转录-聚合酶链式反应的方法检测人PBMC中22个TCRVβ家族的CDR3的谱型和长度,用于分析亚家族的比例以及克隆增殖情况。 二、收集正常人外周血,分离出单核细胞,提取总RNA,利用GeXP多重基因表达系统建立多重逆转录-聚合酶链式反应的方法检测人PBMC中32个TCRVα亚家族的CDR3的谱型长度,用于分析亚家族的克隆增殖情况。 三、收集肺癌患者胸水,分离出单核细胞,提取总RNA,利用上述建立的两种方法分析肺癌患者胸水中TIL的TCRVβ家族和TCRVα家族的克隆增殖情况。 四、提取肺癌患者胸水单核细胞的总RNA,克隆肺癌患者胸水TIL中呈现寡克隆增殖的的TCRVβ基因和TCRVα基因,并构建腺病毒穿梭质粒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ。 五、通过Lipofectamine 2000脂质体转染的方法,将腺病毒骨架质粒与构建的腺病毒穿梭质粒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ共转染HEK293细胞,包装表达目的基因的重组腺病毒。获得的初病毒提取病毒基因组DNA,PCR扩增目的基因。用病毒转染淋巴细胞,检测目的基因表达情况。将鉴定正确的重组嵌合型腺病毒进行大量扩增,过滤TCID50法测病毒滴度。用重组腺病毒感染PBMC,36小时后分别作用于肺癌细胞株NCI-H1299(HLA-A2+)、NCI-H1299(HLA-A2-)、肝癌细胞株HepG2(HLA-A2+),7402(HLA-A2-)。用MTT法在12h、24h、36h三个时间点检测杀伤效果。 结果:成功地利用GeXP多重基因表达系统建立两种多重逆转录-聚合酶链式反应(mRT-PCR)的方法,检测出22个TCRVβ家族以及32个TCRVα家族CDR3长度以及谱型情况。GeXP检测5例肺癌患者胸水中TIL的TCRVβ家族和TCRVα家族的CDR3谱型,结果显示除P2病人所有家族均为多克隆外,其余四例患者均出现单克隆性或寡克隆性增生的现象,通过测序,P1寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD2-TRBJ2S1)和TRAV26(TRAV26-TRAJ20);P3寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD1-TRBJ2S1)和TRAV17(TRAV17-TRAJ20);P4寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD1-TRBJ2S1)和TRAV7(TRAV7-TRAJ5);P5单克隆增生的TRBV17(TRBV17-TRBD2S2-TRBJ2S1)和TRAV5(TRAV5-TRAJ27)。从P5患者中成功克隆获得TCRVα5和TCRVβ17基因,并正确构建了重组腺病毒穿梭质粒pDC315-TCRVα5-IRES-TCRVβ17。通过Lipofectamine 2000脂质体转染的方法,利用腺病毒包装细胞包装重组腺病毒。提取重组腺病毒基因组,PCR扩增得到Fiber35和TCRVβ17基因,说明目的基因已经整合到病毒基因组中。病毒感染PBMC后流式检测,目的基因得到有效表达。用重组腺病毒感染PBMC后,进行抗肿瘤细胞实验,发现经TCRVα5-TCRVβ17基因转染的PBMC的抗肿瘤能力为NCI-H1299(HLA-A2+)>HepG2(HLA-A2+)>NCI-H1299(HLA-A2-)>7402(HLA-A2+)。 结论:GeXP检测五例肺癌患者TIL,均出现了TCRVα和TCRVβ家族的寡克隆或单克隆增生的现象(除P2),推测可能是由于在肿瘤局部的特异性抗原诱导产生的。从肺癌患者胸水中克隆获得TRAV5(TRAV5-TRAJ27)和TRBV17(TRBV17-TRBD2S2-TRBJ2S1)基因,并成功构建了重组腺病毒载体。杀伤实验显示重组TCR腺病毒感染的PBMC对两株肺腺癌细胞株均具有杀伤效果,但对HLA-A2+肺腺癌细胞的杀伤效率明显高于HLA-A2-肺腺癌细胞,并且对非肺癌细胞7402细胞没有杀伤效果,说明该寡克隆增生的TCRVα和TCRVβ家族是由肺癌引起的特异性增殖T细胞。
肺肿瘤;GeXP多重基因表达系统;TCRVβ基因;TCRVα基因;CDR3谱型;重组嵌合型腺病毒
广东药学院
硕士
药剂学
黄树林;邵红伟
2013
中文
R734.2;R979.1
95
2014-04-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）