基于EGFR二聚化靶向策略的多肽疫苗构建
目的:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是EGFR家族的主要成员之一,在众多上皮源恶性肿瘤细胞表面过表达,是抗肿瘤药物的热门靶点。目前已有针对EGFR的单抗与小分子酪氨酸激酶抑制剂类药物上市,但此类药物临床反应率低(15-25％),其背后主要原因是EGFR分子表面及酪氨酸激酶区域具有高度变异性。又配体结合引起的EGFR之间或EGFR与其他家族成员间的“二聚化”是EGFR下游信号通路激活的关键步骤,参与“二聚化”的界面区是结构上高度保守的区域,因此靶向EGFR二聚体界面区有可能提高抗EGFR类治疗的临床反应率。治疗性疫苗属于主动免疫,给药剂量小,仅需少数几次免疫接种,因此,比抗体类产品更具顺应性。恶性肿瘤治疗性多肽疫苗以肿瘤抗原肽为活性组分,可利用基因工程或化学合成手段低成本生产,具有较好的产业发展前景。本实验室前期工作中分离鉴定了一个来自EGFR的B细胞表位肽——EGFR237-267,基于该B细胞表位肽与一种来自麻疹病毒融合蛋白的Th表位肽MVF所构建的“嵌合肽”,可有效刺激体液免疫反应,并在体内外呈现了一定的抗瘤活性,但此类抗原肽的免疫原性尚有改进空间。P64K是一种来自脑膜炎球菌外膜蛋白的新型载体蛋白,免疫原性强、安全性高、并且可通过基因工程方法高效生产,便于质控。本研究拟在前期工作基础上,构建一系列基于EGFR237-267和P64K及MVF的B细胞表位多肽疫苗,并通过免疫原性和体内抗瘤活性比较试验筛选、并确定抗原肽最佳构建形式,以便为研制靶向EGFR二聚体界面的多肽疫苗打下基础。 方法: 1.重组抗原MVF-E的制备 将MVF-E质粒导入E.coli BL21(DE3)中表达,产物加入EDTA及PMSF抑制内源性蛋白酶降解,经阴离子交换层析除去降解蛋白,镍离子螯合亲和层析纯化融合蛋白,肠激酶酶切获得小子分抗原肽。 2.化学偶联抗原P64K*E与P64K*MVF-E的制备 大肠杆菌表达系统中诱导表达P64K蛋白,通过Q柱、Source 30Q、PEI离子交换柱纯化蛋白,获得纯度为90%以上的载体蛋白。B细胞表位E通过化学合成获得,MVF-E通过方法1获得,将载体蛋白与B细胞表位E以及MVF-E用PBS溶解后,按两者摩尔比比例1:10混合,加戊二醛终浓度0.5%反应,反应时间45min,以0.2mol甘氨酸终止反应,获得偶联产物,Sephadex G-25除去小分子物质,样品冻干备用。 3.重组抗原P64K-E与E-P64K的制备 获得P64K-E与E-P64K质粒,导入大肠杆菌表达系统,以镍离子螯合亲和层析纯化融合蛋白。 4.五种构建形式的抗原肽的免疫原性分析 将60只C57BL/6小鼠随机分成6组: Ⅰ组:佐剂对照组; Ⅱ组:MVF-E组; Ⅲ组:P64K*E组; Ⅳ组:P64K*MVF-E组; Ⅴ组:P64K-E组; Ⅵ组:E-P64K组。 初次免疫后每隔两周加强免疫,每次免疫后10天取血,ELISA法检测小鼠血清效价。5.体内抑瘤活性分析 建立C57BL/6小鼠肺癌模型(LLC),于小鼠免疫第三次后14天背肩胛部皮下移植肿瘤,观察小鼠肿瘤成瘤情况、生长情况及身体状况,移植肿瘤7天后每隔两天用游标卡尺测量小鼠的肿瘤体积大小,21天后剥离小鼠肿瘤,称重,分析每组疫苗抑瘤情况及小鼠肺转移情况。 结果: 1.成功制备五种构建形式MVF-E、P64K*E、P64K*MVF-E、P64K-E和E-P64K的多肽疫苗。 2.五种多肽疫苗均在小鼠身上产生较高滴度的抗体,其中化学偶联形式P64K*E产生的滴度最高,其结果优于融合肽的抗体滴度。而以融合肽形式表达的多肽抗原中,抗体滴度MVF-E>E-P64K>P64K-E。 3.比较各组小鼠肿瘤抑制情况,P64K*E、P64K-E和E-P64K组与对照组的肿瘤抑制情况相比具有统计学差异,其中P64K*E组的抑瘤情况最明显。MVF-E与P64K*MVF-E组的抑瘤情况不明显。各组小鼠在21天时均未出现肺转移情况。 结论: 确定了基于B细胞表位EGFR237-267的抗原肽最佳构建形式为P64K*E,为进一步研制相关疫苗打下了良好基础。
表皮生长因子受体;二聚化;靶向策略;多肽疫苗;抗瘤活性;活性组分
广东药学院
硕士
药剂学
李黄金
2013
中文
R978.16
86
2014-04-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）