猪脂肪干细胞源诱导性多能干细胞的获取与鉴定
诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的出现,为突破家畜胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)研究瓶颈带来了曙光,为获取稳定建系的家畜多能干细胞提供了一种可行的替代方案。遗憾的是,至今仅有极少数猪iPSCs能得到嵌合体后代或者核移植后代,并伴有高流产率、高死亡率和高畸形率等问题。因而,如何获得高质量的猪iPSCs已成为该领域的研究热点和难点。本研究探讨了以猪的脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells,ASCs)为源头细胞开展重编程,旨在从源头细胞类型上进一步优化猪的体细胞重编程技术体系,以获得安全、可靠的iPSCs系,为今后进行iPSCs克隆猪生产,丰富转基因猪创制手段,或服务于人类iPSCs的安全性和有效性评价等奠定基础。本研究共开展如下试验。 试验一:源头细胞——猪ASCs的分离培养和生物学特征鉴定。我们通过胶原酶消化法从28日龄的长白猪皮下脂肪组织分离纯化出猪ASCs系,并进行了全面的鉴定。结果发现:猪的ASCs拥有很强的增殖活力,显著高于取自同一头猪的耳源成纤维细胞(Ear fibroblasts,EFs);ASCs在体外能够进行长期传代培养,但拥有较高的异倍体率,且会随着传代周期而逐步上升;ASCs表达间充质干细胞特异性标记物CD44、CD90、CD29的比率依次为100％、96.5%、41.7%,而淋巴细胞标志物CD45、内皮细胞标志物CD31、成纤维细胞标记物HLA-DR的比率依次为0.148%、0.404%、0.08%,可忽略不计,表明细胞纯度很高;在体外合适的诱导条件下,ASCs纵向分化能够产生油红O染色阳性的成熟脂肪细胞,横向分化能够产生茜素红染色阳性的成骨细胞钙化结节;ASCs中OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4、NANOG以及LIN28基因均有内源性表达,但除了KLF4基因的表达量略高于相同代次EFs之外,其余几个重编程转录因子在ASCs中的表达量很低甚至不表达;基因组DNA去甲基化中间产物5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)在ASCs中的含量显著高于相同代次的EFs(P<0.01)。上述结果表明,我们分离得到的猪ASCs系纯度很高且具有可塑性;直接与重编程关联的若干转录因子在ASCs中的本底表达水平很低;由于ASCs处于较低的甲基化修饰状态,从而有助于细胞多能性的重新获得;ASCs的异倍体率较高,在使用前,需要对其进行正常核型细胞株的筛选。 试验二:重编程猪ASCs,开展iPSCs获取和生物学特征鉴定。在借鉴小鼠与人无饲养层细胞、无血清条件下产生iPSCs策略的基础上,以ASCs为源头细胞,利用携带OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC四个外源重编程转录因子的药物可诱导(RevTet-On)型慢病毒表达系统来进行无异源细胞影响下的重编程。结果如下:在有饲养层细胞存在的条件下,就AP阳性的ESCs样克隆形成率而言,ASCs是EFs的6.28倍,而无饲养层细胞条件下,在AP阳性的ESCs样克隆形成率方面,ASCs是EFs的6.33倍;猪iPSCs培养液中添加特异性抑制丝裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase/Extracellular signal-regulated kinasekinase,MEK)信号通路和糖原合成酶-3(Glycogen synthase kinase-3,GSK3)信号通路的两个小分子化合物(2i,即PD0325901和CHIR99021)后,猪iPSCs呈现出小鼠ESCs的形态与传代培养特征;慢病毒感染后,ASCs的异倍体率有升高的趋势;ASCs来源的iPSCs克隆为AP阳性,同时这些克隆也都表达干细胞特异性标记物OCT4、SOX2、NANOG、SSEA-3以及SSEA-4;iPSCs中的关键转录因子OCT4、NANOG、DNMT3B、TERT基因被内源性激活,而其它的多能性基因LIN28、ESRRB、UTF1和DPPA5也被活化;iPSCs在体外能够分化形成拟胚体,表达外、中、内三个胚层的标记基因,体内能够产生畸胎瘤;iPSCs在培养过程中,直接撤除强力霉素(Doxycycline)后,iPSCs会迅速发生分化。上述结果表明,猪ASCs用于重编程的效率显著高于EFs(P<0.01),而且无饲养层、无血清条件下,猪ASCs能够被成功诱导为iPSCs;慢病毒介导外源基因转入可能导致iPSCs异倍体率上升;在重编程后期,2i处理能够促进ASCs经过充分重编程而达到稳定的多能性状态;在重编程过程中,形成的iPSCs已经产生对外源重编程转录因子持续表达的依赖性,而2i培养体系无法独立维持猪iPSCs的自我更新。 总之,我们首次建立了以猪ASCs为源头细胞,在无饲养层细胞、无血清条件下诱导获取猪iPSCs的技术体系,获得了外源重编程转录因子可随时被调控表达的iPSCs系,为今后深入探讨间充质这一特殊来源的猪iPSCs的性状、表观修饰特征以及生产应用提供了极好的材料,为开展猪ESCs培养体系优化研究奠定了基础。
诱导性多能干细胞;脂肪干细胞;高异倍体率;分离纯化;生物学特征鉴定;转基因猪
安徽农业大学
硕士
动物遗传育种与繁殖
张运海;章孝荣
2013
中文
S828.2;S813.3
113
2014-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）