柔嫩艾美耳球虫AHFX株的鉴定及其对鸡血清生化指标的影响
鸡球虫病是由艾美耳属的一种或多种球虫寄生于鸡肠道上皮细胞内而引起的呈世界性分布的原虫病,该病对养鸡业危害十分严重。本试验选用玻璃纸胶囊单卵囊分离技术成功分离到一株球虫,并应用形态学和分子生物学方法进行了鉴定,最终鉴定为柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株;用所获球虫感染雏鸡,对雏鸡感染后不同阶段血清生化指标的变化进行了研究。 首先,从安徽肥西县某鸡场选择具有盲肠球虫病典型症状的病鸡,取病鸡盲肠内容物研碎后加生理盐水搅拌混匀,经40目铜丝筛和260目尼龙筛过滤,滤液经3000r/min,离心10min,收集沉淀。向沉淀物中加入适量2.5％重铬酸钾,置于28℃恒温箱内培养至85%以上卵囊孢子化,孢子化卵囊于4℃冰箱保存备用。以玻璃纸为载体,配合使用空胶囊进行球虫单卵囊分离,先将卵囊液稀释至每滴卵囊液中只含有1~2个卵囊,沾取一滴置于0.5cm×0.5cm的玻璃纸上,观察卵囊的形态学特征,而后置于空胶囊内,经口接种于20只6d龄雏鸡,接种后第5d开始检查粪样中卵囊,以判断雏鸡球虫感染情况。 随后,将上述单卵囊分离所获后代球虫(第一代),按1×104个卵囊/鸡的剂量感染14d龄无球虫雏鸡,每日观察鸡只精神状态,食欲状况,粪便变化。在喂服115h后,每2h检查1次粪便,并记录最早出现卵囊的时间即最短潜在期,同时用沉浮法收集球虫卵囊(第二代),测定最短孢子化时间。分别随机测量50个第一代与第二代球虫卵囊,并对其大小进行差异显著性检验(F检验)。 而后,漂洗、浓缩所获卵囊液,按照常规DNA抽提法进行球虫全基因组DNA的提取。参照Yao-ChiSu等设计的引物:ET1:5'-CGCTGCTGGTTTTACAGGTT-3',ET2:5'-GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC-3'进行PCR扩增,对PCR扩增产物进行序列测定和聚类分析。 最后,将所获柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株按照5×104个卵囊/只的剂量接种80只21d龄雏鸡,分别在感染后0d、5d、9d和13d心脏采血,测定平均体重、免疫器官指数和血清生化等指标。 结果表明:(1)通过单卵囊分离技术感染雏鸡,在20只雏鸡中,有5只感染成功,其成功率达25%。(2)对单卵囊分离所获球虫进行增殖,其第二代卵囊大小为(17.0~23.6)μm×(15.8~20.3)μm,平均大小为21.1μm×18.0μm,卵形指数为1.17,潜在期为140h。将单卵囊所得球虫(第一代)与增殖后球虫(第二代)的球虫卵囊大小进行差异显著性检验(F检验),结果显示差异不显著(P>0.05),表明第二代球虫与第一代球虫卵囊大小相同,且各项其他形态学特征均符合柔嫩艾美耳球虫的特征。因此初步鉴定本次所获球虫为柔嫩艾美耳球虫,暂命名为柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株。(3)应用PCR方法,对所获球虫卵囊进行分子生物学鉴定,成功扩增出463bp的特异性片段;通过序列分析发现所扩增的基因与已报道的柔嫩艾美耳球虫(GQ856310)同一基因片段的同源性高达98.2%,并将测得序列上传至GenBank,序列登录号为JX477100。(4)用所获球虫卵囊进行雏鸡接种试验显示:与对照组相比,感染后第5d平均体重、血清Na、TP和ALB含量极显著降低(P<0.01),血清Ca、GOT、LDH-L和IgA的含量或活性极显著升高(P<0.01),血清K、GPT和NO含量或活性显著升高(P<0.05),血清CAT活性显著降低(P<0.05);第9d时,平均体重和血清ALB含量极显著降低(P<0.01),血清IgG含量极显著升高(P<0.01),血清GSH-Px、T-SOD和TP活性或含量显著降低(P<0.05);第13d时,平均体重和血清T-SOD活性极显著降低(P<0.01),胸腺指数、血清CAT、TP的活性或含量显著降低(P<0.05),血清Ca含量显著升高(P<0.05);整个试验过程中,脾脏指数、法氏囊指数、血清P、Mg、ALP和IgM的含量或活性均未表现出明显变化(P>0.05)。 综上所述,本研究应用单卵囊分离技术成功分离到一株艾美耳球虫,并通过形态学和分子生物学方法对其进行了鉴定,确定为柔嫩艾美耳球虫AHFX株;用该株球虫感染雏鸡,测定感染后血清生化指标,初步探明了柔嫩艾美耳球虫AHFX株感染雏鸡后不同阶段血清生化指标的变化规律。本试验的研究结果可为安徽肥西县鸡球虫病的防治提供理论依据。
柔嫩艾美耳球虫;鸡球虫病;安徽肥西株;单卵囊分离技术;鉴定方法;血清生化指标
安徽农业大学
硕士
临床兽医学
李培英;徐前明
2013
中文
S858.31;S852.723
55
2014-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）