动物源大肠杆菌耐药基因与HPI毒力基因的检测及相关性分析
大肠杆菌(Escherichiacoli)是一种重要的能引起食源性疾病的人畜共患病原菌,随着抗菌药物的滥用,大肠杆菌耐药性情况日益严重,而细菌的耐药性可通过多种途径进行传播,引起交叉耐药,严重威胁着人类的健康。耶尔森菌强毒力岛(highpathogenicityisland,HPI)通过夺取宿主中的铁元素来增强细菌在宿主体内存活的机率,进而加重对机体患病的感染能力,毒力岛的发现和研究,对深入了解细菌性疾病的发生、发展过程以及对疾病的预防控制都有着深远影响。 以大肠杆菌耐药基因和HPI标志性基因为研究对象,设计特异性引物,采用PCR技术对两类基因进行特异性扩增,通过反应条件和反应体系的优化,建立大肠杆菌ESBLs耐药基因(TEM、SHV)和HPI毒力基因(irp1、irp2、fyuA)的双重PCR检测方法,并对大肠杆菌中耐药基因和HPI毒力基因之间的相关性进行了分析。具体研究内容和结果如下: 1、动物源大肠杆菌分离株耐药表型的检测 采用NCCLS推荐的K-B法来检测大肠杆菌分离株(猪源25株、鸡源12株)对20种抗菌药物的耐药性,以大肠杆菌ATCC25922为药敏质控菌,记录并分析实验结果。 猪源大肠杆菌分离株对于常见的抗菌药物阿莫西林(24/25,96％)、苯唑西林(23/25,92%)、氨苄西林(22/25,88%)、羧苄西林(21/25,84%)、阿莫西林/棒酸(21/25,84%)、氯霉素(23/25、92%)表现出很强的耐药性(≥80%)。 鸡源大肠杆菌分离株对于兽医临床中常见的抗菌药物苯唑西林(12/12,100%)、氨苄西林(11/12,91.7%)、羧苄西林(11/12,91.7%)、阿莫西林(9/12,81.8%)、阿莫西林/棒酸(9/12,81.8%)表现出很强的耐药性(≥80%)。 其次猪鸡源大肠杆菌对链霉素(18/25,72%、7/12,63.6%)、强力霉素(19/25,76%、6/11,54.5%)、复方新诺明(14/25,56%、7/11,63.6%)、诺氟沙星(13/25,52%、7/11,63.6%)表现出较强的耐药性(50%~80%)。大肠杆菌分离株呈现出多重耐药,其中对8~14种抗菌药物具有多重耐药性的菌株占总分离株73.0%(27/37)。该结果对于大肠杆菌分离株中的耐药性做了一个初步的检测分析,为后续基因型试验提供基础数据。 2、动物源大肠杆菌分离株耐药基因和HPI毒力岛基因的PCR检测 以大肠杆菌耐药基因与HPI毒力岛基因作为研究切入点,根据GenBank中已发表的大肠杆菌标志性基因序列,分别设计合成了大肠杆菌耐药基因TEM、SHV、OXA、cmlA、floR、sul-I、sul-II、tetA、tetB、aac(3)-II、aph(3’)-II和毒力岛irp1、irp2、fyuA等14对特异性引物,提取大肠杆菌DNA作为模板,对大肠杆菌耐药基因和HPI毒力岛基因进行PCR检测,并对PCR扩增反应条件进行优化。结果表明,大肠杆菌耐药基因和HPI毒力岛基因引物TEM、SHV、OXA、cmlA、floR、sul-I、sul-II、tetA、tetB、aac(3)-II、aph(3’)-II、irp1、irp2和fyuA能扩增出目的片段,大小分别是118、132、190、467、601、925、179、344、388、412、232、799、414、948bp。 通过优化后的PCR反应条件和反应体系对所有大肠杆菌分离株的耐药基因和HPI毒力基因进行了检测,为建立双重PCR同时检测以上两类基因提供数据和理论基础。 3、动物源大肠杆菌ESBLS耐药基因和HPI毒力基因双重PCR检测及相关性分析 在单重PCR反应条件和反应体系优化的基础上,对双重PCR反应条件和反应体系中的引物浓度和Tm值进行优化。检测结果显示,检出irp1+TEM、irp1+SHV、irp2+TEM、irp2+SHV、fyuA+TEM、fyuA+SHV基因的阳性率分别为13.5%、13.5%、21.6%、21.6%、16.2%、16.2%。在大肠杆菌中扩增出118、132、799、414、948bp的特异性目的条带,而甲型副伤寒沙门氏菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌中则不能扩增出。灵敏度试验表明,该反应体系的检测灵敏度为1.5×103CFU/mL。irp2缺失株试验表明,irp2中仍能检测出TEM、SHV、sulII、aac(3)-II、cmlA、floR基因。大肠杆菌中ESBLs耐药基因和HPI基因通过双重PCR方法均能特异检测出,缺失株试验证实两类基因间无明显相关性。 10种耐药基因型(OXA和sulI除外)和耐药表型的阳性符合率大于50%,表明巢湖流域大肠杆菌耐药性的分布及耐药基因的存在情况较为普遍;本试验中建立的大肠杆菌ESBLs耐药基因和HPI毒力基因双重PCR检测方法适用于大肠杆菌的快速检测,同时能对人畜共患大肠杆菌病的预防和控制提供了理论指导。
大肠杆菌;耐药基因;HPI毒力基因;PCR检测
安徽农业大学
硕士
营养与食品卫生学
祁克宗
2013
中文
R378.21;R372
56
2014-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）