油茶皂苷分离纯化及生物活性研究
油茶(CamelliaoleiferaAbel)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物,是我国特有的木本食用油料树种。油茶籽富含茶油和油茶皂苷(即茶皂素)。由于油茶皂苷种类繁多,且无标准样品,对其进行定性与定量比较困难。目前市场上流通的茶皂素纯度较低,限制了其应用范围,因此研究高纯度茶皂素的工业化纯化技术,将会提高油茶饼粕及精炼副产物的利用价值。 本研究以油茶(CamelliaOleiferaAbel)皂苷粗品为材料,研究油茶皂苷的HPLC检测方法,建立工业化纯化技术,分离纯化单体化合物并鉴定其化学结构,同时进行生物活性的探讨。主要结果如下: 1、建立了油茶皂苷的HPLC-UV/ELSD分析测定方法。测定条件:流速1.0mL/min,进样量5μl,A相为0.2％乙酸,B相为100%乙腈,0~15min内流动相B由35%升至40%,45min时升到60%,55min时再升到80%,60min时回至35%;紫外检测波长为280nm,蒸发光散射检测器漂移管温度80℃,气体压力25psi,增益50,灵敏度0.01。紫外检测器与蒸发光检测器串联使用,其检测灵敏度互为补充,可全面地检测到油茶皂苷的主要组分。以oleiferasaponinA1为标准品,在280nm下HPLC-UV检测,结果显示:油茶皂苷在0.0096~6mg/mL范围内呈良好的线性相关,相关方程为y=553272x-2357.1,相关系数R2=0.9997。HPLC分析表明,油茶籽与饼粕中皂苷的种类相同,其化学性质稳定,在茶油加工过程中几乎没有变化,为油茶皂苷的综合开发提供便利。 2、建立了油茶皂苷的HPLC/TOF-MS定性测定方法。分析表明油茶皂苷的分子质量主要集中在1039~1379D之间,与茶树(Camelliasinensis)中的皂苷分子质量范围基本一致。通过HPLC-MS/MS分析,推测了一个油茶皂苷化合物的m/z为1201([M-H]-),分子式为C58H89O26,其结构式与日本山茶(CamelliajaponicaL)种子中含有的名为camelliasaponinB1的皂苷是相同的,这说明山茶属(Camellia)植物中含有的皂苷具有很高的相似性。通过HPLC-MS/MSn分析,推测油茶皂苷中存在较多分子量相差2和30的化合物,分子量相差2的化合物推测为4位C上的-CHO被-CH2OH取代;分子量相差30的化合物推测为4位C上的-CHO被-CH3取代,同时21位C上的-OH被H取代。 3、开发了一种高纯度油茶皂苷工业化纯化技术。采用0.2μm陶瓷膜粗滤后与30000D透-5000D浓有机膜组合,对油茶皂苷进行初步分离,其后结合大孔树脂吸附技术进行纯化,喷雾干燥后得到高纯度油茶皂苷,得率为30.0%,纯度为94.2%。纯化后的油茶皂苷为白色粉末,粘性降低,其起泡性也得到明显改善。膜组件可以重复使用,大孔树脂价格低廉并可多次使用,连续上样8次,其吸附率和解析率基本不变,纯化过程仅使用乙醇溶剂并可回收,低碳环保,适合工业化开发。 4、分离纯化出一个油茶皂苷新化合物。利用硅胶柱、C18柱及HPLC制备液相,分离纯化得到一个油茶皂苷化合物,经高分辨ESI-MS/MS分析,其m/z为1215.57975([M?H]?),推测其分子式为C59H92O26,经IR、1HNMR和13CNMR及二维谱鉴定其为三萜皂苷的新化合物oleiferasaponinA1。 5、初步研究了油茶皂苷的抑菌生物活性。研究表明100μg/mL油茶皂苷对植物性病原真菌和酵母菌具有较强的抑制活性,而10000μg/mL的油茶皂苷对试验处理组细菌几乎没有抑制活性,因此油茶皂苷可用于真菌抑制剂的开发;试验处理中,油茶皂苷对玉米小斑病菌抑制作用最明显,其MIC值为250μg/mL,油茶皂苷对茶炭疽病菌抑制作用最弱,其MIC值为2100μg/mL。电子显微镜观察250μg/mL的油茶皂苷处理的玉米小斑病菌菌丝,发现其顶端及中部细胞膨大呈泡囊状,阻碍了菌丝的生长,而油茶皂苷浓度达到2100μg/mL时,才对茶炭疽病菌具有较为明显的抑制作用,说明油茶皂苷对真菌的抑制作用具有一定的选择性;同时,油茶皂苷对H2O2损伤模型的PC12细胞具有保护特性,纯化后总皂苷和单体化合物oleiferasaponinA1的25、125μM剂量组与H2O2组差异均达极显著水平,为其在药物中的开发提供依据。
油茶皂苷;分离纯化;生物活性;HPLC检测
安徽农业大学
博士
茶学
夏涛
2013
中文
TS224.8;TS201.2
73
2014-03-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）