酸敏感离子通道1a在酸诱导的大鼠关节软骨细胞自噬中的作用及其机制研究
酸敏感离子通道(Acid-sensingionchannels,ASICs)是一类配体门控性离子通道,属上皮钠通道(EnaC)/退化因子基因(DEG)通道家族中的一个成员,能被细胞外pH下降或H+浓度上升激活。研究表明,ASIC1a在一些组织酸化性疾病如炎症、脑缺血、肿瘤等发生发展中起着重要作用。本课题组前期研究证实ASIC1a在模拟RA发病历程的大鼠佐剂性关节炎(AdjuvantArthritis,AA)关节软骨细胞上有较强表达,并参与组织酸化诱导的关节软骨细胞损伤过程。最近研究表明,组织酸化性疾病RA的患者关节软骨细胞上存在自噬的过度激活并在关节软骨破坏中发挥重要作用,但具体机制尚不清楚。为此,本研究选用大鼠原代关节软骨细胞为研究对象,采用胞外酸化刺激模拟AA大鼠关节滑液环境,探讨ASIC1a是否在酸化诱导的关节软骨细胞自噬中发挥作用及其作用的分子机制。 目的:本研究以体外培养的大鼠关节软骨细胞为研究对象,观察不同程度的胞外酸化刺激后不同时间软骨细胞自噬情况以确定胞外酸化条件。观察ASIC1a非特异性阻断剂阿米洛利(Amiloride)和特异性阻断剂(PcTX1)作用后软骨细胞自噬水平的变化,并检测其对MAPK信号通路中ERK1/2及p38蛋白磷酸化水平的影响,探讨ASIC1a是否在酸化诱导的大鼠软骨细胞自噬中发挥作用及其可能的分子机制。 方法: 1.采用Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠关节软骨细胞,将细胞分为五组分别在pH为7.4、7.0、6.5、6.0、5.5的培养基孵育,观察不同pH诱导的软骨细胞自噬情况。并且于胞外酸化(pH6.0)0min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h时间下采用MTT法检测软骨细胞生存率,westernblot法检测自噬蛋白LC3的表达。 2.将软骨细胞分为pH7.4环境下培养的正常组、pH6.0的酸化组、以及经ASIC1a非特异性阻断剂Amiloride和特异性阻断剂PcTX1处理的酸化组,RT-PCR法检测各组细胞自噬基因Beclin-1mRNA的表达,westernblot法检测自噬蛋白LC3及ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白的表达,透射电子显微镜法观察自噬小体数量的变化。 3.将软骨细胞分为pH7.4环境下培养的正常组、pH6.0的酸化组、经ASIC1a特异性阻断剂PcTX1及ERK1/2、p38MAPK磷酸化抑制剂(PD98059、SB203580)处理的酸化组,分别采用RT-PCR法和westernblot法检测各组细胞自噬基因Beclin-1mRNA、自噬蛋白LC3的表达。 结果: 1.胞外酸化对体外培养的关节软骨细胞自噬的活化作用 pH5.5和pH6.0胞外酸化刺激均能明显升高软骨细胞自噬水平,且这两组之间差异无显著性;MTT法结果显示,与pH7.4正常组相比,软骨细胞生存率随酸化程度增加而降低;Westernblot检测发现在酸化3h之内自噬蛋白LC3表达呈上升趋势,3h之后其表达下降,由此可以推测酸化刺激诱导的自噬发生为一动态过程。在此基础上,选取胞外酸化(pH6.03h)为关节软骨细胞自噬体外模型。 2.ASIC1a对胞外酸化诱导的关节软骨细胞自噬的影响 RT-PCR结果显示酸化组软骨细胞Beclin-1自噬基因表达水平明显高于正常组,westernblot检测结果显示酸化组软骨细胞LC3、磷酸化的ERK1/2和p38MAPK蛋白表达水平均明显高于正常组,且TEM检测发现酸化组软骨细胞胞质中出现较多的细胞自噬小体。而ASIC1a阻断剂组软骨细胞自噬基因Beclin-1、自噬蛋白LC3及ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白表达水平较酸化组明显降低,且自噬体数量明显减少。 3.ERK1/2、p38MAPK在ASIC1a调控大鼠关节软骨细胞自噬中的作用 RT-PCR及Westernblot结果显示,与酸化组相比较,ASIC1a特异性阻滞剂PcTX1、ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059预处理组显著抑制Beclin-1mRNA及LC3蛋白表达。而与酸化组比较,p38MAPK抑制剂SB203580组未明显改变大鼠关节软骨细胞Beclin-1mRNA及LC3蛋白表达。 结论: 1.胞外酸化刺激能明显诱发体外培养的大鼠关节软骨细胞自噬,降低软骨细胞生存率,并随着酸化程度增加而加剧。 2.抑制ASIC1a表达对胞外酸化刺激诱导的大鼠关节软骨细胞自噬有抑制作用。 3.阻断ASIC1a对酸诱导的大鼠关节软骨细胞自噬具有抑制作用,其机制可能是通过阻断ASIC1a,抑制MAPK信号通路中ERK1/2磷酸化水平来实现的。
酸敏感离子通道1a;胞外酸化;关节软骨细胞;细胞自噬;动物模型
安徽医科大学
硕士
药理学
陈飞虎;葛金芳
2013
中文
R681.3;R977.7
80
2014-01-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）